于雪芳，黃燮南

(1．遵義醫(yī)學院藥理學教研室暨貴州省基礎藥理重點實驗室，貴州 遵義 563099;2．沭陽縣人民醫(yī)院，江蘇 宿遷 223600)

人參總皂苷(total ginsenosides，TG)是我國名貴中藥材人參(Panax ginseng C．A．Meyer)的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性。近年來我們實驗室證實，在心血管系統(tǒng)方面，TG能抑制由注射野百合堿所引起的大鼠右心室肥大，且該作用與其抑制絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)和鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CaN)信號通路有關［1］;TG還能抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)所致血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖［2］，明顯減輕由球囊導管損傷所致大鼠頸動脈內膜的異常增生［3］，TG的抗 VSMC增殖效應與其抑制MAPK信號通路、促進一氧化氮生成和抗脂質過氧化等作用有關［2、3］。近年有報道表明，CaN 信號通路參與病理性血管壁重構的形成［4］，但TG的抗增殖效應是否與其抑制CaN信號通路有關目前尚不清楚。本工作擬采用培養(yǎng)的VSMCs為研究對象，以AngⅡ為促增殖劑，觀察TG對CaN信號通路的影響。

1 材料

1．1 藥品與試劑 TG購自北京天然藥物研究院，從人參莖和葉中提取所得，純度約93%，其中含人參皂苷 Rb15．26%，Rg15．20%，Re 21．60%，Rd 13．65%和其他人參皂苷類化合物。CaN引物購自寶生物工程(大連)有限公司;CaN的催化亞基CnA兔抗大鼠多克隆抗體和Actin兔抗大鼠多克隆抗體分別為 Stressgen公司(加拿大)和 Santa Cruz公司產品。

1．2 實驗動物 雄性SD大鼠，體重約350 g，購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心，許可證:SCXK20020003。

2 方法

2．1 細胞培養(yǎng)及給藥方案 取大鼠胸主動脈中層，用貼壁法培養(yǎng)VSMCs［2］。然后取生長狀態(tài)良好的第3－11代細胞，同步化后隨機分為4組:對照組，不加任何藥物;模型組，加AngⅡ10－7mol/L;TG 0．05 mg/ml組，加入 AngⅡ10－7mol/L+TG 0．05 mg/mL;TG 0．1 mg/kg 組，加入 AngⅡ10－7mol/L+TG 0．1 mg/mL。

2．2 Real time RT－PCR 檢測VSMCs中CaN mRNA表達 將VSMCs(106細胞/瓶)接種于50 mL無菌培養(yǎng)瓶中，加入藥物作用48 h，然后把消化后的細胞轉入離心管中以1000 rpm速度離心5 min，留細胞沉淀;加入Trizol液500μL，室溫下靜置5 min，再加氯仿 500 μL，振搖 15sec，在 4℃ 下以12000 rpm行第2次離心(20 min);取上清液300 μL并加入300μL異丙醇，再在4℃下以12 000 rpm離心10 min，棄上清液;在沉淀中加75%乙醇，然后在4℃下以12000 rpm再離心5 min，清洗2次，去乙醇，即得RNA?？諝飧稍? min后加入0．1%DEPC水100μL溶解，并進行RNA純化及樣品純度鑒定。兩步法逆轉錄－聚合酶鏈反應如下。

首先從基因庫GeneBank中查出相關引物序列，由TaKaRa生物工程公司合成相應引物見(見表1)。PCR反應體系為20μl，反應條件:第一步，95℃ ×8 min;第二步，95℃ ×15 sec，退火溫度 ×1 min。循環(huán)45次。結果分析處理(相對定量法)，Ct值為統(tǒng)計參數(shù)依次計算下列數(shù)據(jù):①Ct average=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重復管);②dCt=Ct average－中間值;③基因的表達=2^(－dCt);④相對定量=目的基因的表達/內參基因的表達。

表1 用于real time RT－PCR的引物信息

2．3 Western－blotting檢測VSMC中CnA蛋白質的表達水平 將VSMCs以106細胞/瓶接種于50 mL無菌培養(yǎng)瓶中，經藥物作用48 h后吸凈培養(yǎng)液，用4℃的PBS洗3次，每次約5 mL，吸凈PBS后加入RIPA裂解液200μL，再用細胞刮輕輕刮下裂解物，把含沉淀的液體吸入1．5 mL離心管中并置旋渦混勻器30 s，然后置于冰上10 min使細胞充分裂解。接著在4℃下以14 000 g/min的速度離心20 min，取上清液，按BCA蛋白檢測試劑盒說明書測定蛋白濃度，再分裝為40 ng/20μL/孔，在100℃煮沸3 min后上樣。經SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維膜上，用封閉液封閉2 h，加入以一抗稀釋液稀釋的抗CnA多克隆抗體(1∶1 000))和 actin多克隆抗體(1∶600)，37℃輕搖2 h。先用TBST液快速洗3次，再輕搖沖洗5 min并重復3次，然后以二抗稀釋液稀釋HRP標記的羊抗兔IgG(1∶1 000)，先用TBS液快速洗3次，再進行3次上述的輕搖沖洗，增強化學發(fā)光法顯色，用凝膠圖象分析系統(tǒng)進行結果分析。

2．4 統(tǒng)計分析方法 采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計分析;數(shù)值變量經正態(tài)性檢驗后，滿足條件者以均數(shù)±標準差(x±s)表示，組間比較采用ONE－WAY ANOVA，有差異者進一步做組間的兩兩比較(方差齊者使用LSD法，方差不齊的使用Gunnett＇T3法);P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3．1 TG對VSMCs中CaN mRNA表達的影響 經AngⅡ10－7mol/L處理的模型組的CaN mRNA表達，較正常對照組約升高10倍(P＜0.01)，但以TG 0．05 mg/mL 或 0．1 mg/mL 與同量 AngⅡ同時處理細胞后，則使VSMCs中的CaN mRNA表達較模型組明顯降低(P＜0.05)，陽性對照藥左旋精氨酸(L－arg)0．1 mg/mL也有同樣作用，TG 0．01 mg/mL組的作用甚至優(yōu)于陽性藥L－arg組(P＜0.05)(見圖1)。

圖1 TG對AngⅡ所致VSMCs中CaN mRNA表達升高的影響

3．2 TG對VSMCs中CnA蛋白表達的影響 與上述CaN mRNA表達的實驗結果相吻合，模型組的CnA蛋白表達明顯高于對照組(P＜0.01)，而TG 0.05 mg/mL組和0．1 mg/mL組的CnA蛋白表達較模型組明顯降低(P＜0.01)(見圖2)。

圖2 TG對AngⅡ所致VSMC中CnA(CaN的催化亞基)蛋白質表達的影響

4 討論

血管壁重構包括血管壁的結構和功能的改變，是高血壓、血管形成術后再狹窄和動脈粥樣硬化等疾病的主要特征［5］，引起重構的刺激包括血壓的變化、炎癥反應、細胞外基質成分的改變和血管損傷等，這些刺激使血管固有的中層VSMCs激活，并通過促進VSMC的增殖、遷移和血管基質的改變等多種過程，導致血管重構［6］。經皮腔內血管形成術后引起的血管再狹窄是這一病理狀態(tài)的常見例子。我們原先的報道表明，TG能明顯抑制球囊損傷所致大鼠頸動脈內膜的增生［3］，提示TG具有一定的抗血管重構作用。新近有人發(fā)現(xiàn)，CaN信號通路參與病理性血管重構的調節(jié)［4］。因此，有必要闡明TG的抗血管重構作用是否與其對CaN通路的抑制有關。

近年的研究表明，神經肽catestatin通過激活CaN信號通路而促進VSMC的增殖［7］，一氧化氮/蛋白激酶G(NO/PKG)系統(tǒng)也通過調節(jié)CaN的活性而部分地參與其VSMC增殖的抑制［8］。我們先前曾報道，AngⅡ10－7mol/L能引起 VSMCs的明顯增殖［2］，而本次實驗的結果表明，該濃度的AngⅡ能使VSMC中的CaN表達在mRNA水平上升高約10陪，其催化亞基CnA的蛋白質水平也有顯著增高，提示AngⅡ促VSMC增殖作用也可能需要CaN信號通路的激活。更值得注意的是，TG 0．05 mg/mL和0．1 mg/mL能明顯抑制AngⅡ10－7mol/L所致VSMC的增殖［2］，而在本次實驗中也顯示該兩濃度的TG也能顯著抑制AngⅡ所引起的CaN和CnA表達的升高，該結果強烈提示，TG的抗AngⅡ所致VSMC增殖作用至少部分與其抑制CaN信號通路的表達有關。因血管重構與VSMC增殖關系十分密切，因此，TG的抗血管重構作用也可能與其抑制CaN通路的表達部分有關。

［1］Qin N，Gong Q H，Wei L W，et al．Total ginsenosides inhibit the right ventricular hypertrophy induced by monocrotaline in rats［J］．Biol．Pharm．Bull，2008，31(8):1530 －1535．

［2］于雪芳，黃燮南．人參莖葉總皂苷抑制血管平滑肌細胞增殖作用研究［J］．中藥藥理與臨床，2009，25(5):22－25．

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［4］Esteban V，Méndez－ Barbero N，Jiménez－ Borreguero LJ，et al．Regulator of calcineurin 1 mediates pathological vascular wall remodeling［J］．J．Exp．med，2011，208(10):2125－2139．

［5］Heeneman S，Sluimer J C，Daemen M J．Angiotensin － converting enzyme and vascular remodeling［J］．Circ．Res，2007，101:441 －454．

［6］Berk B C．Vascular smooth muscle growth:autocrine growth mechanisms［J］．Phisiol．Rev，2001，81(3):999－1030．

［7］Guo X，Zhou C，Sun N．The neuopeptide catestatin promotes vascular smooth muscle cell proliferation through the Ca++ －calcineurin－NFAT signaling pathway［J］．Biochem Biophys．Res．Commun，2011，407(4):407 －812．

［8］Li S J，Sun N L．Regulation of intracellular Ca++and calcineurin by NO/PKG in proliferation of vascular smooth muscle cells［J］．Acta Pharm．Sin，2005，26(3):323 －328．