劉愛東，成 敏

(1．遵義醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099;2．濰坊醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，山東 濰坊 261041)

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是排除了高血壓、冠心病及其它已知疾病所致的心肌損傷而獨(dú)立存在的病理生理狀態(tài)，表現(xiàn)為心肌肥大，心臟收縮和(或)舒張功能障礙。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，實(shí)驗(yàn)研究指出多種代謝紊亂構(gòu)成了糖尿病心肌功能和結(jié)構(gòu)改變的基礎(chǔ)。而原癌基因的激活與表達(dá)增強(qiáng)是心肌肥大發(fā)生的重要途徑之一。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鏈尿菌素(streptozocozin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠為研究對象，通過觀察胰島素(Insulin)或燈盞花素(Breviscapine，Bre)對DM早期大鼠血糖、心肌原癌基因c－myc表達(dá)的影響，探討Insulin或Bre對糖尿病模型大鼠心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 STZ(Alexis公司);Bre(云南個舊生物藥業(yè)有限公司，規(guī)格為5mL∶20 mg);總RNA提取試劑盒和DEPC購自華美生物工程公司;ONE－STEPRT－PCR試劑盒購自Qiagen公司;血糖測定試劑盒購自四川省邁克科技有限責(zé)任公司;引物由上海生工合成。

1．2 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥 雄性Wistar大鼠(n=48)，體重(225±26)g，購自四川大學(xué)動物中心(Ⅱ級，證書編號24101107)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，用簡單隨機(jī)抽樣方法隨機(jī)選取12只為正常對照組(Normal組)，余36只禁食10 h后按(60 mg·kg－1，ip)一次性腹腔注射STZ溶液。STZ溶液臨用前用0．1 mmol·L－1枸櫞酸緩沖液(pH 4.5)配成1%濃度，Normal組注射等容積0．1 mmol·L－1枸櫞酸緩沖液。給藥48 h后經(jīng)尾靜脈采血測定空腹血糖，以血糖值≥16.65 mmol/L作為糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。建模成功后，再用簡單隨機(jī)抽樣方法隨機(jī)分為糖尿病非用藥組(DM組，n=12 NC 0．2 ml·kg－1·d－1，ip)，胰島素治療組(Insulin 組，n=12，Insulin 2 U·kg－1·d－1，sv)，Bre 治療組(Bre 組，n=12，Bre 100 mg·kg－1·d－1，ip)，Normal組(n=12，NS 0．2 mL·kg－1·d－1，ip)，各組連續(xù)給藥7 d。給藥期間各組大鼠自由進(jìn)水、飲食，DM組、Insulin組和Bre組各死亡1只。

1．3 實(shí)驗(yàn)觀察及標(biāo)本留取 各組分別在模型建立后的第1天、第3天、第7天測量血糖及稱體重。取各組第3天的大鼠(每組n=6)，在測量血糖及稱體重完畢后，以3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后剪開胸腔，迅速摘除心臟，吸干血液后，放入液態(tài)氮中冷凍，留用RNA提取。

1．4 血糖測定 葡萄糖氧化酶法，單位以mmol/L計(jì)。

1．5 逆轉(zhuǎn)錄 －聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR檢測)1．5．1 心肌組織總RNA的提取 按照Trizol試劑盒說明操作，在紫外線分析儀上測定RNA濃度及A260/A280吸光度比值(1．80 ～2．12)，以確定RNA純度。

1．5．2 引物的選擇 c－myc和 β－ actin的 PCR特異性引物的選定(見表1)。

表1 PCR引物序列

1．5．3 逆轉(zhuǎn)錄 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作， 產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)的cDNA模板。

1．5．4 PCR擴(kuò)增 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性 94℃，1 min→變性95℃，1 min→退火 c－myc 55℃，1 min→延伸72℃，1 min，共35個循環(huán)。

1．5．5 凝膠電泳 取10μl最后PCR產(chǎn)物和βactin的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖溴化乙錠染色的凝膠上運(yùn)行。電泳結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析，c－myc mRNA的相對含量以其與β－actin(吸光度×面積)之比值表示。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，資料為定量正態(tài)資料，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用重復(fù)測量的方差分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠體重的變化 在建模成功后第3天、第7天，DM組的大鼠體重均比Normal組的體重減輕(P＜0.05)，其余各組大鼠體重與Normal組比較無明顯變化(見表2)。

表2 各組大鼠體重的變化(x±s)

2．2 各組大鼠血糖水平的變化 在建模成功后第1天、第3天、第7天時(shí)，DM組大鼠血糖濃度均顯著高于Normal組 (P＜0.01)，Insulin組、Bre組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血糖濃度均低于DM組(P＜0.01)，但高于Normal組(P＜0.01)(見表3)。

表3 各組大鼠血糖水平的比較(x±s)

2．3 原癌基因c－myc mRNA表達(dá) 在建模成功后第3天，DM組大鼠心肌c－myc mRNA表達(dá)顯著高于Normal組(P＜0.01)，Insulin組或Bre組的大鼠心肌 c－myc mRNA表達(dá)均低于 DM組(P＜0.01)，與Normal組比較無明顯差異(P＞0.05)。(見圖1、表4)

表4 各組大鼠心肌原癌基因c－myc mRNA的表達(dá)(x±s)

圖1 c－myc與β－actin電泳凝膠成像

3 討論

依據(jù)大量的流行病學(xué)、病理解剖學(xué)和動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，DCM是一個獨(dú)立的原發(fā)病，是糖尿病心臟病的最早表現(xiàn)，是由糖尿病引起的與血管疾病同時(shí)伴行或單獨(dú)發(fā)生的特異性心肌?。?］。而且有研究表明:波動性高糖與單純性高糖一樣，具有促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的作用，對DCM的發(fā)展均具有促進(jìn)作用［2］。DCM主要的病理表現(xiàn)為局灶性心肌壞死、心肌肥大，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，細(xì)小動脈管壁增厚及纖維化，管腔狹窄，心肌纖維化，心室重量/體重比增加［3］。

c－myc是體內(nèi)編碼核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖分化的調(diào)控。在新生兒和成年鼠心臟檢測出c－myc基因表達(dá)，在體外培養(yǎng)的肥大心肌細(xì)胞，檢測出高表達(dá)c－myc基因的mRNA，而c－myc基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物也會誘發(fā)心臟大小的增加。有研究表明:高糖可促進(jìn)原癌基因c－myc和cfos的表達(dá)［4］。而活性增強(qiáng)的蛋白激酶 C(Protein kinase C，PKC)與細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，二者協(xié)同作用可致細(xì)胞內(nèi)c－myc蛋白水平增高。在糖尿病時(shí)，PKC是促使正常心肌發(fā)生病變的重要媒介，且心肌損傷的程度與PKC增強(qiáng)的活性呈正性相關(guān)。高血糖狀態(tài)下的氧化應(yīng)激可增強(qiáng)PKC的活性［5］，引起Ca2+超載，離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常，從而影響心肌結(jié)構(gòu)和功能。PKC的活性升高可激活調(diào)節(jié)原癌基因c－fos、c－jun等的表達(dá)，導(dǎo)致心肌纖維化、左心室肥大，左心室收縮及舒張功能減退［6］。

Bre是從燈盞花中提取的黃酮類成分，是燈盞花中發(fā)揮心血管作用的有效成分［7］。已有的研究顯示，Bre主要擴(kuò)張血管，降低血管阻力，增加腦、腎等器官血流量，改善微循環(huán)，并有抗血小板及紅細(xì)胞聚集的作用。燈盞花素又是PKC抑制劑，在腎臟燈盞花素可通過抑制PKC活性而阻止高糖環(huán)境腎系膜細(xì)胞c－fos、c－jun蛋白表達(dá)而用于防治糖尿病腎?。?］。本研究應(yīng)用STZ成功建立糖尿病大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DM組大鼠在第3天、第7天的體重均比Normal組的體重減輕(P＜0.05)，在第1天，第3天、第7天的大鼠血糖濃度均比Normal組高(P＜0.01)，第3天大鼠心肌c－myc基因的mRNA表達(dá)增強(qiáng)，而Insulin或Bre可以分別降低血糖水平和下調(diào)c－myc基因的mRNA表達(dá)。因此，Insulin、Bre可抑制糖尿病心肌原癌基因c－myc的表達(dá)，對DCM有一定的保護(hù)作用。

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