宋凱英，徐 平，史艷紅

(1．遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州遵義 563099;2．河南省扶溝縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 扶溝461300)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征是指在睡眠時由 于上氣道的狹窄或阻塞所引起的反復的呼吸暫?；虻屯?，睡眠呼吸暫停指數(shù)大于或等于5次/h，出現(xiàn)慢性間歇性低氧。OSAS是臨床常見病，而且具有潛在危險性，可造成全身多系統(tǒng)、多器官功能的損害。Punjabi NM［1］對OSAS成人進行流行病學調(diào)查顯示OSAS患病率3% ～7%，Young等［2］流行病學研究證實男女發(fā)病率之比約為2．4∶1，男女發(fā)病率分別高達9% ～15%和4% ～9%，患病率隨年齡遞增。20世紀80年代以來OSAS受到了廣泛的關注，臨床和基礎研究在全世界范圍內(nèi)取得了迅速發(fā)展，但其發(fā)生發(fā)展及引起相關并發(fā)癥的具體機制方面至今仍未徹底闡明。本實驗擬通過于大鼠雙側舌腭弓、咽腭弓及舌根處注射透明質(zhì)酸鈉凝膠建立上呼吸道阻塞模擬阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征模型，同時觀察腦組織的損傷及腦血管病變情況，為本課題深入進行OSAS與缺血性腦卒中的研究提供一個穩(wěn)定、可行的動物模型。

1 材料

1．1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠40只，重200～250g，雌雄分籠飼養(yǎng)，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物中心提供［許可證號SCXK(渝)2007－0005］。

1．2 實驗試劑 醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠(上海其勝生物制劑公司，批號110552－01);戊巴比妥鈉(北京索萊寶科技有限公司，批號CAS#57－33－0)。

1．3 實驗儀器 鼻鏡(廣東新星醫(yī)療器械廠);插件式多參數(shù)神經(jīng)監(jiān)護儀(NTS－3000 B，上海諾誠醫(yī)療器械有限公司);電子顯微鏡(DM 4000B，德國Leica公司);Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司);石蠟切片機(RM－2235，德國Leica公司)。

2 方法

Wistar大鼠隨機抽簽法分為正常對照組(10只)、OSAS組(30只)。適應性喂養(yǎng)1周開始造模。

2．1 阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征組模型 以2%的戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后，取仰臥位，鼻鏡做開口器暴露口咽腔，于雙側舌腭弓、咽腭弓及舌根處注射透明質(zhì)酸鈉凝膠至大鼠出現(xiàn)呼吸暫停，將舌體牽拉于口外，防止其窒息死亡，直至大鼠完全清醒。①出現(xiàn)伴有胸腹反常運動的呼吸暫停，即為阻塞性呼吸暫停②監(jiān)測腦電、口鼻氣流、血氧飽和度:無菌針灸針作針電極，取大鼠雙目中上方約0.5 cm、兩側乳突分別作 FP1、FP2、A1、A2 腦電電極的位置(FP1、FP2代表記錄電極，A1、A2代表參考電極)，口鼻氣流熱敏傳感器貼于大鼠雙側前鼻孔監(jiān)測口鼻氣流，將鼠尾穿過血氧探頭監(jiān)測外周血氧飽和度。分別于注射透明質(zhì)酸鈉前1 wk、注射后4 wk，以2%的戊巴比妥鈉溶液25 mg/kg做腹腔內(nèi)注射造成淺麻醉狀態(tài)模擬自然睡眠狀態(tài)(即對強刺激有反應，對淺刺激無反應)，監(jiān)測2 h，大鼠清醒時腦電波為高頻率，低幅度;睡眠時腦電波為低頻率，高幅度。人工計數(shù)2 h內(nèi)每只大鼠的呼吸暫停次數(shù)，計算呼吸暫停指數(shù)。

2．2 實驗動物取材 13 wk后，以2%的戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg作腹腔內(nèi)注射麻醉，斷頭取腦，取皮質(zhì)海馬置多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，切片固定于載玻片上，蘇木素/伊紅染色(hematoxylin and Eosin stain，HE stain)，顯微鏡下觀察大鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)腦組織及腦血管。

2．3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17．0軟件分析，計量資料正態(tài)性檢驗后以x±s表示，采用 t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3．1 OSAS模型 OSAS大鼠模型建立后，觀察中發(fā)現(xiàn)睡眠打鼾、口唇稍發(fā)紺、呼吸暫停伴胸腹式反常呼吸運動，呼吸暫停后數(shù)秒伴血氧飽和度的減低。清醒期一般情況無異常。睡眠呼吸監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)大鼠口鼻氣流的呼吸波形消失，同時人工觀察見大鼠胸腹式反常呼吸運動，造模前后平均血氧飽和度(mean oxygen saturation，MSaO2)、最低血氧飽和度(lowest oxygen saturation，LSaO2)、呼吸暫停指數(shù)(apnea index，AI)比較有統(tǒng)計學意義，可判定為阻塞性呼吸暫停綜合征。造模及睡眠呼吸監(jiān)測見圖1A －1D。經(jīng)t檢驗，OSAS大鼠 MSaO2、LSaO2較造模前降低，AI較造模前增高，比較有差異(P＜0.05)(見表1)。

表1 OSAS大鼠造模前后 MSaO2、LSaO2、AI比較

3．2 皮質(zhì)海馬HE染色 對照組:神經(jīng)元排列整齊緊密，層次分明，細胞數(shù)量較多，胞質(zhì)均質(zhì)紅染，核大而圓，核仁清晰。OSAS組:神經(jīng)元排列紊亂，細胞減少，部分胞漿空泡樣變，胞質(zhì)嗜酸性增強，核染色質(zhì)不均勻，核周間隙增大，核固縮深染，呈紫藍色梭形或三角形，腦小血管數(shù)量有所增加。(見圖2～圖3)。

4 討論

以往國內(nèi)外學者有采用低壓氧艙或常壓低氧艙，造成全身低氧動物模型，雖然接近人類OSAS病理生理特點，但無法模擬呼吸暫停時的咽腔負壓情況;也有國外學者采用氣管切開造口并設置氣管內(nèi)活瓣，計算機自動開關活瓣，但其阻塞部位在氣管而非上氣道。上氣道狹窄是OSAS發(fā)病機制中最重要的因素，軟腭后區(qū)氣道是呼吸暫停的始發(fā)部位和主要阻塞部位。故本實驗借鑒柳忠祿等［3］的方法通過在Wistar大鼠口咽部和舌根處注射透明質(zhì)酸鈉凝膠人為造成上氣道狹窄，導致睡眠時的呼吸暫停，以模擬人類OSAS發(fā)病的解剖學機制。

為了減少對動物的損傷，本實驗未采用埋置電極的方法，試用針灸針作為針電極，但因為淺麻醉情況下模擬睡眠，針刺時痛刺激使大鼠易覺醒并反抗，導致電極部分脫落，干擾大，并且因接觸面積較小導電性能略差，腦電圖的圖像不很穩(wěn)定。我們設想如果現(xiàn)在使用的盤狀電極可進一步改進縮小，用脫毛液脫去動物毛發(fā)，將電極緊貼皮膚后膠布固定，像人類做動態(tài)腦電圖檢查一樣描記腦電波形，對大鼠既無手術損傷，又能達到電極與皮膚的充分接觸。當然這種改進需監(jiān)護儀廠家的技術支持。

人類呼吸停止10 s判定為呼吸暫停。Carley等［4］采用大鼠呼吸停止≥2．5 s作為呼吸暫停的判斷標準。大鼠的呼吸頻率為66～114次/min，2．5秒的呼吸暫停發(fā)生了2次以上呼吸周期的缺失。由于實驗設備限制，大鼠不能使用胸腹帶判斷胸腹式呼吸的存在與否，實驗中監(jiān)測到有一定頻率及幅度的正弦波為大鼠的正常呼吸波，當正弦波消失，變成一條直線時，即為呼吸停止，同時人工觀察見胸腹式反常呼吸運動，判斷為阻塞性呼吸暫停。當呼吸恢復，首先出現(xiàn)幅度較大的正弦波，規(guī)律的呼吸波、直線波再現(xiàn)，如此反復。注射前動物出現(xiàn)阻塞性呼吸暫停，可能與大鼠口腔深，舌體較大，舌體后墜，加之戊巴比妥鈉麻醉后咽腔肌肉松弛，軟組織塌陷有關。

實驗中觀察到OSAS大鼠睡眠打鼾(類似一種喉鳴音)、口唇稍發(fā)紺、呼吸暫停伴胸腹式反常呼吸運動，呼吸暫停后數(shù)秒伴血氧飽和度的減低。目前國內(nèi)外實驗中關于大鼠的血氧檢測不多見，我們通過淺麻醉狀態(tài)下鼠尾靜脈末梢血氧監(jiān)測發(fā)現(xiàn)呼吸暫停確實伴有血氧減低，更進一步闡明了OSAS模型的可行性，造模前后的平均血氧飽和度、最低血氧飽和度及呼吸暫停指數(shù)差異性顯著。說明通過咽腔注射透明質(zhì)酸鈉凝膠建立的OSAS模型成功。

有學者認為間歇低氧類似于缺血/再灌注，可造成神經(jīng)元丟失，導致相應的腦功能障礙。楊宇等［5］發(fā)現(xiàn)慢性間斷性缺氧大鼠學習記憶能力下降，電鏡可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結構變化，突觸小泡減少，膜結構模糊不清，毛細血管內(nèi)皮腫脹，表明慢性間斷性缺氧可引起神經(jīng)元細胞超微結構損傷。Tsukamoto K等［6］研究發(fā)現(xiàn)，呼吸暫停時增加缺氧誘導因子－1(hypoxia inducible factor－1，HIF－1)的轉錄活性，引起血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表達，導致腦缺血后血管的再生。但VEGF過表達卻導致腦血管通透性增加，加重腦缺血缺氧，發(fā)生血管源性腦水腫［7］。Lavie等證實慢性低氧誘導腦小動脈VEGF mRNA表達增強，VEGF合成增加，血管結構重構，平滑肌細胞增殖，小動脈壁增厚，管腔狹窄［8］。

鑒于大腦皮質(zhì)及海馬對缺氧比較敏感，是腦內(nèi)負責記憶、信息處理及信號傳遞的重要部位，本實驗重點觀察皮質(zhì)及海馬的結構改變。研究中發(fā)現(xiàn)在OSAS大鼠大腦皮質(zhì)及海馬中，存在神經(jīng)元的減少，排列紊亂，細胞空泡樣變，細胞核固縮，細胞壞死，伴小血管不同程度增生等表現(xiàn)，可能是OSAS前期腦功能減退、顱內(nèi)壓增高、腦動脈硬化至腦血管閉塞的一個演變過程，為深入進行OSAS與缺血性腦卒中的研究提供一個可行的動物模型。本文采用HE染色只能對細胞形態(tài)作出初步評價，但壞死細胞個數(shù)、血管增生程度及數(shù)量改變尚不能明確，后續(xù)實驗可采用更先進的手段，如共聚焦顯微鏡、PCR技術、免疫組化檢測等，對細胞功能狀態(tài)進行評價，進一步完善對OSAS模型的研究。

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［5］楊宇，譚勝玉，張新民，等．慢性間歇性缺氧對認知功能及海馬CA1區(qū)IGF－1表達的影響［J］．中國臨床心理學雜志，2007，15(1):85－87．

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