陳小燕，廖永美，趙 逵

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州遵義 563099)

結(jié)直腸癌是胃腸道中最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率逐年增高，發(fā)病年齡也明顯提前。結(jié)直腸癌組織中一小部分具有自我更新的能力，并在腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起重要作用的細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞，是腫瘤根治的靶點(diǎn)。Lgr 5是最新發(fā)現(xiàn)的Wnt通路的靶基因，Lgr 5蛋白是腸道干細(xì)胞標(biāo)志物［1］，在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，與結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)［2］，可能作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。阿司匹林作為一種臨床常用的非甾體抗炎藥(NSAIDs)，除具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎作用外，研究表明它還可以降低腺瘤和結(jié)直腸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，有效預(yù)防結(jié)直腸癌發(fā)生［3］。近年來(lái)大量流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室研究均表明NSAIDs能抑制甚至逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌癌前病變。阿司匹林抗腫瘤作用可能是通過(guò)COX－2途徑實(shí)現(xiàn)，NSAIDs能降低結(jié)直腸癌前腺瘤及癌組織中COX－2表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)。然而并非所有結(jié)直腸癌均表達(dá)COX－2，對(duì)此類COX－2陰性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，NSAIDs的作用如何研究尚少。此外，阿司匹林是如何作用于結(jié)直腸癌干細(xì)胞，對(duì)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr 5又有何影響，Lgr 5與COX－2之間有何聯(lián)系，都尚不清楚。本研究擬通過(guò)阿司匹林對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株COX－2高表達(dá)的HT －29、COX －2 陰性表達(dá)的 SW －480［4］中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)gr 5表達(dá)影響的研究，探討阿司匹林預(yù)防結(jié)直腸癌發(fā)生的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)胞株 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT－29購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW－480購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。

1．1．2 藥物和主要試劑 阿司匹林、McCoy’S 5a培養(yǎng)基及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，兔抗人Lgr 5多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，小鼠抗人β－actin、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG及辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)以及RIPA裂解液購(gòu)自武漢博士德公司。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞的培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT－29、SW480培養(yǎng)于含10%胎牛血清的McCoy’S 5a培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80% ～90%融合時(shí)，用0．25%胰蛋白酶－0．02%EDTA混合液進(jìn)行消化傳代。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系株 HT－29、SW－480細(xì)胞中Lgr 5蛋白的表達(dá) 將HT－29、SW480細(xì)胞以每瓶5×105個(gè)細(xì)胞接種于50 cm2的組織培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后分別加入含0、2．5、5．0、10．0 mmol/L 阿司匹林的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集不同藥物濃度處理后的細(xì)胞，按RIPA方案提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，定量上樣(每孔約30μg)后行8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1h。加入兔羊抗人Lgr 5多克隆抗體(1:400稀釋)、小鼠抗人β－actin一抗(1:5000 稀釋)，4℃過(guò)夜，0．1%TBST 漂洗 3 ×10 min，于室溫與HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG孵育1 h，0．1%TBST漂洗3×10 min。應(yīng)用Luminol顯色，暗室X線膠片曝光，調(diào)整曝光時(shí)間直至最佳條帶，拍照。用凝膠圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組內(nèi)的比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Western blot檢測(cè)的結(jié)果顯示，在HT－29和SW480細(xì)胞中，從對(duì)照組到不同濃度的阿司匹林組，可見Lgr 5蛋白印記條帶顏色由深到淺(見圖1)。在HT－29細(xì)胞中，Lgr 5蛋白的校準(zhǔn)值(Lgr 5蛋白的積分光密度值/β－actin蛋白的積分光密度值)分別為 1．0175 ±0．14796、0．7600 ± 0．09018、0．5976±0．11822，均低于對(duì)照組的 1．3025 ±0．17115(見表1);在SW480細(xì)胞中，不同濃度的阿司匹林作用組的Lgr 5蛋白的校準(zhǔn)值(Lgr 5蛋白的積分光密度值/β－actin蛋白的積分光密度值)分別為 1．1350 ± 0．11030、0．8450 ± 0．17311、0．5774±0．10575，均低于對(duì)照組的 1．5050 ±0．20857(見表1)，對(duì)照組與不同濃度組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩種細(xì)胞的組間相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)(見圖2)。

圖1 Westem－blot檢測(cè)Lgr 5蛋白在細(xì)胞系HT－29細(xì)胞和SW480細(xì)胞中不同組別的表達(dá)

表1 HT－29細(xì)胞和SW480細(xì)胞中Lgr 5蛋白質(zhì)在不同組別表達(dá)的比較

圖2 HT－29細(xì)胞和SW480細(xì)胞中不同組別表達(dá)Lgr 5蛋白(Lgr 5/β－actin)的比較

3 討論

近年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞理論的提出為腫瘤研究提供了新的方向，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生的根源，也是徹底根治腫瘤的靶點(diǎn)［5］。多項(xiàng)研究表明Lgr 5+成體干細(xì)胞是腸道腫瘤細(xì)胞的起源［6，7］。在關(guān)于結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)Lgr 5是Wnt通路的靶基因，在小腸隱窩基底部、結(jié)腸隱窩、胃腺體底部及毛囊等多種組織中表達(dá)，而且是包括腸道和毛囊在內(nèi)的多種自我更新組織的成體干細(xì)胞標(biāo)志物［8］。Barker等［9］首次提出了 Lgr 5 作為腸道腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的理論，隨后大量研究表明Lgr 5是結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物。Battle等也報(bào)道Lgr 5和其他正常腸道干細(xì)胞基因在人結(jié)腸癌細(xì)胞中都選擇性表達(dá)，指出Lgr 5+細(xì)胞群是結(jié)直腸癌干細(xì)胞。Lgr 5在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，與癌癥的發(fā)生、侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后密切相關(guān)［10］，表明其參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展。研究證實(shí)，Lgr 5蛋白高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，可能是通過(guò)提高結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞自我更新能力，加速了腫瘤細(xì)胞的增殖和未分化程度，腫瘤干細(xì)胞亞群增多使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療及放療的抵抗能力增強(qiáng)，降低了患者對(duì)腫瘤治療方式的敏感性，從而導(dǎo)致了腫瘤的復(fù)發(fā)以及治療失敗等［11］。因此，Lgr 5可作為結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。

大量的證據(jù)表明，服用阿司匹林或其他NSAIDs可以減少患結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)、改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后以及降低術(shù)后復(fù)發(fā)率等。Jacobs等［12］研究也發(fā)現(xiàn)每日服用阿司匹林可使其癌癥死亡風(fēng)險(xiǎn)降低16%。然而其對(duì)腫瘤干細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚，對(duì)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr 5有何影響，Lgr 5與COX－2之間又有何聯(lián)系，都有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，隨著阿司匹林濃度的增加，結(jié)腸癌細(xì)胞株HT－29和SW480中Lgr 5蛋白的表達(dá)呈明顯的下降趨勢(shì)，并具有良好的量－效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。這表明阿司匹林可能是通過(guò)降低Lgr 5的表達(dá)而抑制腫瘤干細(xì)胞，從而達(dá)到防治結(jié)直腸癌的作用。通過(guò)對(duì)遺傳性及散發(fā)性結(jié)直腸癌患者的研究表明阿司匹林等NSAIDs可能干預(yù)癌癥發(fā)生的初始步驟，如抑制Wnt/βcatenin信號(hào)通路［13］。COX促進(jìn)PGE2的生成而抑制β－catenin降解，導(dǎo)致Wnt/β－catenin信號(hào)通路活化，促進(jìn)Wnt通路靶基因Lgr 5的轉(zhuǎn)錄。Lgr受體與R脊柱蛋白密切結(jié)合，即使是在少量Wnt信號(hào)刺激時(shí)也能夠顯著增強(qiáng)Wnt的信號(hào)作用［14］，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生。因此，抑制COX的表達(dá)是NSAIDs 抗 腫 瘤 的 重 要 因 素［15］，阿 司 匹 林 等NSAIDs可以減弱β－catenin/TCF敏感基因(如Lgr 5)的轉(zhuǎn)錄，并成量效關(guān)系［13］，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。

NSAIDs可以抑制COX－2表達(dá)，阻斷結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，同時(shí)選擇性COX－2抑制劑塞來(lái)昔布通過(guò)誘導(dǎo)TCFs降解而阻礙Wnt/β－catenin信號(hào)通路，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株，但此作用卻不依賴COX －2［16，17］，故 NSAIDs 拮抗腫瘤的作用機(jī)制并不只局限于COX－2。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示COX－2高表達(dá)的HT－29、COX－2陰性表達(dá)的SW480兩種細(xì)胞的組間相比均無(wú)顯著性差異(P＞0．05)，進(jìn)一步表明阿司匹林抗大腸腫瘤的機(jī)制可能涉及到COX－2途徑和非 COX－2途徑。Lev－Ari等［4］通過(guò)塞來(lái)昔布聯(lián)合姜黃素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖的研究，以及王春暉等通過(guò)選擇性及非選擇性COX－2抑制劑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響的研究，均同樣表明上述觀點(diǎn)。NSAIDs對(duì)結(jié)腸癌的預(yù)防作用主要通過(guò)非COX－2依賴途徑［18］，其作用機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。非COX－2依賴性途徑的作用機(jī)制是近期研究的重點(diǎn)，希望借此能找到新藥研究的靶位。Benamouzig等［19］研究也表明阿司匹林可降低COX－2低表達(dá)的結(jié)腸腺瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)率，而對(duì)COX－2高表達(dá)者無(wú)作用。NSAIDs能抑制如HCT116和SW480等COX－2陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)。阿司匹林誘導(dǎo)COX－2陰性表達(dá)的SW480細(xì)胞凋亡的一潛在機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Bcl－2和上調(diào)Bax的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的［20］。此外，有關(guān)于NSAIDs在治療其他疾病中主要以非COX－2途徑發(fā)揮作用的證據(jù)越來(lái)越多，例如，Celecoxib以非COX－2依賴途徑拮抗順鉑抗胃癌細(xì)胞的活性，COX－2抑制劑通過(guò)非COX依賴性途徑對(duì)抗心肌氧化損傷以及COX－2抑制劑NS398通過(guò)COX－2非依賴途徑誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞BxPC－3細(xì)胞凋亡等。

綜上所述，本研究結(jié)果表明阿司匹林可能通過(guò)COX－2途徑和非COX－2途徑，并且以非COX－2途徑為主，減少結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr 5蛋白的表達(dá)而抑制腫瘤干細(xì)胞，從而起到防治結(jié)直腸癌的作用，為NSAIDs阿司匹林臨床預(yù)防結(jié)直腸癌提供了相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而關(guān)于非COX－2途徑涉及的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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