陳 瑞，王偉強(qiáng)

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012；2.皖西學(xué)院 安徽省植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，安徽 六安237012）

室溫離子液體［1-2］是指一類室溫或相近溫度下完全由離子組成的有機(jī)液體化合物，簡稱離子液體，也稱室溫熔融鹽。

有研究發(fā)現(xiàn)：用離子液體［Bmim］Cl預(yù)處理纖維素，將經(jīng)離子液體預(yù)處理過的纖維素和纖維素酶混合后，加入到醋酸—醋酸鈉緩沖液中，60℃下進(jìn)行糖化。隨著預(yù)處理溫度的升高，平均糖化速度呈現(xiàn)先增大后減小的變化，90℃時(shí)達(dá)到最大，比未處理的提高了近70%。纖維素的聚合度［3］隨預(yù)處理溫度的變化與平均糖化速度的變化規(guī)律相一致。比較經(jīng)離子液體處理前后纖維素的表觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)纖維素出現(xiàn)了明顯的斷裂，聚合度下降。纖維素酶分子通常由催化結(jié)構(gòu)域、纖維結(jié)合結(jié)構(gòu)域及二者的連接區(qū)所組成，纖維素酶分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過芳香族氨基酸上的芳香環(huán)和葡萄糖環(huán)的堆積力吸附到纖維素上，再由纖維結(jié)合結(jié)構(gòu)上其余氫鍵形成的殘基與相鄰纖維素鏈形成的氫鍵將單個纖維素鏈從纖維素聚集體表面疏解下來，然后催化域從纖維素鏈的末端作用，產(chǎn)生葡萄糖或纖維二糖［4］。聚合度的下降減少了纖維素的結(jié)晶區(qū)，增加了纖維素酶催化域的作用位點(diǎn)，因而提高了酶解糖化的效率。盡管離子液體［Bmim］Cl可以改變纖維素的空間結(jié)構(gòu)［5］，提高其糖化效率，但離子液體的毒性目前依然研究較少。離子液體［Bmim］Cl對釀酒酵母的生長和發(fā)酵是否有影響，影響程度如何，未見相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)在適宜的溫度下，研究發(fā)酵液中各種物質(zhì)的變化，初步探討離子液體［Bmim］Cl對釀酒酵母生長和發(fā)酵［6］的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：釀酒酵母AY92022（Saccharomyces cerevisiae AY92022）

試劑：離子液體［Bmim］Cl購于河南利華制藥，酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、氯化鉀、硫酸、蒽酮、葡萄糖等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌AY92022的培養(yǎng)

配制5組液態(tài)PDA培養(yǎng)基，其中1組作為對照組，不加［Bmim］Cl，其余4份加入不同質(zhì)量的［Bmim］Cl，使［Bmim］Cl濃度分別為10-3g／g，10-4g／g，10-5g／g，10-6g／g。將釀酒酵母AY92022接種到100mL的液態(tài)PDA培養(yǎng)基中，28℃、200r／min，培養(yǎng)48h。

1.2.2 酵母菌數(shù)量的測定

采用分光光度計(jì)法測菌體濃度［7］。

1.2.3 還原糖含量的測定

采用蒽酮比色法［8］。

1.2.4 乙醇含量的測定

采用重鉻酸鉀比色法［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生長情況

［Bmim］Cl對釀酒酵母AY92022生長的影響見圖1。

圖1 ［Bmim］Cl對釀酒酵母生長的影響

其中-3，-4，-5，-6分別代表發(fā)酵液中離子液體濃度為：10-3g／L，10-4g／L，10-5g／L，10-6g／L，對照組的發(fā)酵液中不含有離子液體［Bmim］Cl。

從圖1可以看出：與對照組一樣，釀酒酵母AY92022在接種后4h內(nèi)菌體濃度無變化，但很快進(jìn)入對數(shù)生長期，24h左右進(jìn)入穩(wěn)定生長期，菌體濃度不再增加。當(dāng)［Bmim］Cl的濃度小于10-6g／L時(shí)，離子液體對菌體生長的影響不大。隨著［Bmim］Cl濃度的逐漸增大，菌體的數(shù)量減少。當(dāng)［Bmim］Cl的濃度達(dá)到10-5g／L，酵母菌的生長受到明顯影響，當(dāng)［Bmim］Cl的濃度達(dá)到10-3g／L時(shí)，穩(wěn)定期菌體濃度為0.0101g／mL，為對照組的63.5%，經(jīng)過進(jìn)一步單因素方差分析，離子液體對釀酒酵母AY92022的生長有明顯的抑制作用（P＜0.05）。最后，酵母菌進(jìn)入衰退期，菌體濃度下降。

2.2 葡萄糖含量變化情況

［Bmim］Cl對釀酒酵母AY92022分解葡萄糖的影響見圖2。

圖2 ［Bmim］Cl對釀酒酵母分解葡萄糖的影響

其中-3，-4，-5，-6分別代表發(fā)酵液中離子液體濃度為：10-3g／L，10-4g／L，10-5g／L，10-6g／L，對照組的發(fā)酵液中不含有離子液體［Bmim］Cl。

由圖2可以看出：前4h，酵母菌在延滯期，發(fā)酵液內(nèi)葡萄糖含量變化不大。在8h至24h，隨著酵母菌進(jìn)入生長期，葡萄糖的代謝量增加，其中對照組菌體增加最快，葡萄糖的代謝也最快。24h后，酵母菌進(jìn)入穩(wěn)定生長期，雖然菌體濃度不再增加，但對葡萄糖依然有較大的需求量。隨著［Bmim］Cl濃度的逐漸增大，發(fā)酵液中葡萄糖的代謝量減少。當(dāng)［Bmim］Cl的濃度達(dá)到10-5g／L，葡萄糖的代謝受到明顯影響，當(dāng)［Bmim］Cl的濃度達(dá)到10-3g／L時(shí)，葡萄糖的代謝受到的影響最大，濃度為1.59%，為對照組的2.41倍，經(jīng)過進(jìn)一步單因素方差分析，離子液體對釀酒酵母AY92022的生長有明顯的抑制作用（P＜0.05）。

2.3 乙醇含量變化情況

［Bmim］Cl對釀酒酵母AY92022產(chǎn)乙醇的影響見圖3。

圖3 ［Bmim］Cl對釀酒酵母產(chǎn)乙醇的影響

其中-3，-4，-5，-6分別代表發(fā)酵液中離子液體濃度為：10-3g／L，10-4g／L，10-5g／L，10-6g／L，對照組的發(fā)酵液中不含有離子液體［Bmim］Cl。

由圖3可以看出：前24h，菌體處于延滯期和對數(shù)生長期，葡萄糖的消耗主要用于酵母菌的生長，發(fā)酵液內(nèi)乙醇含量變化不大。24h后，酵母菌進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體菌濃度達(dá)到最大，酵母菌開始代謝產(chǎn)生乙醇。隨著葡萄糖的進(jìn)一步消耗，乙醇的含量快速增加，到48h時(shí)，菌體進(jìn)入衰退期，菌體濃度開始下降，乙醇含量不再增加。同樣，當(dāng)離子液體［Bmim］Cl的濃度比較小時(shí)，發(fā)酵液中乙醇含量變化的不大，當(dāng)［Bmim］Cl的濃度達(dá)到10-5g／L，此時(shí)發(fā)酵液內(nèi)的乙醇產(chǎn)量受到明顯影響，當(dāng)［Bmim］Cl的濃度達(dá)到10-3g／L時(shí)，發(fā)酵液內(nèi)乙 醇濃度為4.83g／L，為對照 組 的61.4%，經(jīng)過進(jìn)一步單因素方差分析，離子液體對釀酒酵母AY92022的生長有明顯的抑制作用（P＜0.05）。

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