王界年，王圣泳，沈 斌，龐廣保，韋伍英，黎木蘭，封廖蕓，黎 靜

(廣西醫(yī)科大學(xué)1.2008級七年制臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生、2.生理學(xué)教研室，廣西南寧 530021)

腎上腺素(adrenalin，Adr)脫氨生成的H2O2、甲醛和甲胺等代謝產(chǎn)物被認為是一個引起心血管疾病的高危因子［1］，是心腦血管疾病的重要誘因。因此，應(yīng)激時交感神經(jīng)活動增強，腎上腺髓質(zhì)釋放Adr增多，Adr代謝產(chǎn)物如H2O2、甲醛和甲胺等可以損傷血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)［2］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖對憤怒心理應(yīng)激大鼠血管的內(nèi)皮依賴性舒縮功能具有一定的調(diào)節(jié)作用［3］。本研究通過制作離體大鼠胸主動脈環(huán)，在體外分別采用H2O2、甲醛和甲胺孵育損傷血管內(nèi)皮，觀察海帶多糖對這些血管環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒縮功能的影響，進一步探討海帶多糖對血管內(nèi)皮細胞保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物與藥品試劑 苯腎上腺素(phenylephrine，PE)，去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)，上海禾豐制藥有限公司;H2O2、甲醛(formaldehyde)、甲胺(methylamine，MA)，Sigma 公司;乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，上海三愛思試劑有限公司;海帶多糖(laminar polysaccharide，LP)，本實驗室自行提取，其糖含量為71.0%，硫酸根含量為83.28 mg·g－1;SD大鼠♀♂各半(200～250 g，廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)。

1.2 大鼠胸主動脈環(huán)的制備及處理 大鼠頸椎脫臼處死，立刻取出胸主動脈，移至盛有冰冷Krebs-Henseleit(K-H)液的培養(yǎng)皿中，分離血管周圍組織，剪成長度約3 mm的動脈環(huán)。用不銹鋼絲小鉤穿過動脈環(huán)，置于盛有K-H液的離體灌流裝置中，一端與浴槽底部相連，另一端通過張力換能器與Powerlab生物信號采集系統(tǒng)相連，持續(xù)通入體積分數(shù)為95%O2和5%CO2的混合氣體。各組血管環(huán)在浴槽中以0.5 g張力維持30 min，1.5 g張力維持90 min后，加 PE(10－6mol·L－1)刺激后，加入 ACh(10－6mol·L－1)檢測血管環(huán)內(nèi)皮的完整性。本研究中藥物濃度均指浴槽內(nèi)的藥物終濃度。

1.3 實驗分組

1.3.1 H2O2損傷實驗 分為對照組(加入等量KH 液)、模型組(H2O2100 μmol·L－1)、海帶多糖高劑量組(LP-H，H2O2100 μmol·L－1+LP 100 mg·L－1)和海帶多糖低劑量組(LP-L，H2O2100 μmol·L－1+LP 10 mg·L－1)。

1.3.2 甲醛損傷實驗 分為對照組(加入等量K-H液)、模型組(甲醛 1.5 μmol·L－1)、海帶多糖高劑量組(LP-H，甲醛 1.5 μmol·L－1+LP 100 mg·L－1)和海帶多糖低劑量組(LP-L，甲醛 1.5 μmol·L－1+LP 10 mg·L－1)。

1.3.3 甲胺損傷實驗 分為對照組(加入等量K-H液)、模型組(甲胺 100 μmol·L－1)、海帶多糖高劑量組(LP-H，甲胺 100 μmol·L－1+LP 100 mg·L－1)和海帶多糖低劑量組(LP-L，甲胺 100 μmol·L－1+LP 10 mg·L－1)。

1.4 實驗步驟 按照分組方法加藥后孵育30 min，給予PE(10－6mol·L－1)刺激后加入累積濃度的ACh(10－8mol·L－1～10－4mol·L－1)，每 3 min 加入一個濃度，記錄血管環(huán)張力，分別計算血管的舒張百分比/%=(M－m)/(M－M0)×100%，M為PE刺激后血管環(huán)的最大收縮張力，m為某濃度ACh刺激血管環(huán)的最小舒張張力，M0為PE刺激前血管環(huán)的初始張力。換洗平衡后加入累積濃度的NE(10－9mol·L－1～10－5mol·L－1)，每 3 min 加入一個濃度，記錄血管環(huán)張力。分別計算血管環(huán)的收縮百分比/%=(N/n)×100%，其中N為某濃度NE刺激時的最大收縮張力，n為血管環(huán)加NE前的初始張力。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件分析系統(tǒng)，組間比較用單因素方差分析。

Tab 1Effect of ACh on aortic rings’endothelium dependent relaxation after H2O2is added(±s，n=6)

Tab 1Effect of ACh on aortic rings’endothelium dependent relaxation after H2O2is added(±s，n=6)

*P＜0.05 vs normal group;#P＜0.05 vs model group

Group Relaxation of different Ach concentration after H2O2is added/%10 －8mol·L－1 10 －7mol·L －1 10 －6mol·L －1 10 －5mol·L －1 10 －4mol·L －1 Control group 7.84 ±7.18 17.86 ±5.19 30.61 ±16.13 82.97 ±16.13 101.9 ±7.70 Model group 2.73 ±1.85 10.77 ±3.18 21.59 ±3.23 52.00 ±15.11* 73.87 ±10.60*LP-L 6.51 ±9.30 19.62 ±11.99 32.81 ±14.55 69.39 ±12.69 90.01 ±8.23#LP-H 7.94 ±8.39 20.52 ±13.92 32.73 ±16.85 78.58 ±17.00# 95.00 ±8.25#

2 結(jié)果

2.1 海帶多糖對H2O2損傷血管內(nèi)皮依賴性舒縮功能的影響 結(jié)果顯示(Tab 1)，從ACh濃度10－5mol·L－1開始，模型組的舒張反應(yīng)與對照組比較明顯降低(P＜0.05)，LP-H的舒張反應(yīng)與模型組比較明顯升高(P＜0.05);當(dāng) ACh濃度為10－4mol·L－1時，LP-L的舒張反應(yīng)明顯高于模型組(P＜0.05)。但各組血管環(huán)對NE引起的收縮反應(yīng)差異無顯著性(P＞0.05)。

2.2 海帶多糖對甲醛損傷血管內(nèi)皮依賴性舒縮功能的影響 結(jié)果顯示見Tab 2，在10－8～10－6mol·L－1濃度的ACh中，模型組的舒張反應(yīng)明顯高于對照組(P＜ 0.05);在 10－8～ 10－7mol·L－1濃度的ACh中，LP-H的舒張反應(yīng)低于模型組(P＜0.05)。從10－7mol·L－1濃度的 NE 開始(Tab 3)，模型組的收縮反應(yīng)高于對照組，而LP-L和LP-H的收縮反應(yīng)低于模型組(P＜0.05)。

2.3 海帶多糖對甲胺損傷血管內(nèi)皮依賴性舒縮功能的影響 結(jié)果表明(Tab 4)，從10－5mol·L－1濃度的ACh開始，模型組的血管環(huán)舒張反應(yīng)明顯低于對照組(P＜0.05)，而LP-H的血管環(huán)舒張反應(yīng)明顯高于模型組(P＜0.05)。從 10－7mol·L－1濃度的NE開始，模型組的收縮反應(yīng)高于對照組，而LP-H的收縮反應(yīng)低于模型組(P＜0.05，見Tab 5)。

3 討論

VEC可以產(chǎn)生和分泌多種生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管的舒縮功能。當(dāng)VEC損傷時，其釋放的舒縮因子失衡，如釋放的血管收縮因子增多而釋放的舒張因子減少，從而引起血管舒縮功能失調(diào)［4］。此外，一些化學(xué)物質(zhì)可以通過作用于VEC來調(diào)節(jié)血管的舒縮功能。例如，ACh可通過作用于 VEC，刺激VEC釋放舒血管物質(zhì)NO，使血管舒張;NE也可以通過調(diào)節(jié)VEC釋放各種因子，調(diào)節(jié)血管的舒張［5］。

Tab 2 Effect of ACh on aortic rings’endothelium dependent relaxation after formaldehyde is added(±s，n=6)

Tab 2 Effect of ACh on aortic rings’endothelium dependent relaxation after formaldehyde is added(±s，n=6)

*P＜0.05 vs normal group;#P＜0.05 vs model group

Group Relaxation of different Ach concentration after formaldehyde is added/%10 －8mol·L－1 10 －7mol·L －1 10 －6mol·L －1 10 －5mol·L －1 10 －4mol·L －1 Control group 5.93 ±4.46 17.19 ±6.60 31.99 ±8.15 79.98 ±8.01 95.04 ±4.74 Model group 54.11 ±15.84* 66.49 ±15.74* 76.41 ±18.95* 94.15 ±20.74 103.61 ±19.11 LP-L 47.36 ±17.66 60.54 ±13.75 72.07 ±9.12 88.63 ±11.01 97.37 ±9.74 LP-H 33.52 ±9.33# 55.13 ±8.75#68.62 ±12.58 90.30 ±14.84 97.9 ±13.53

Tab 3Effect of NE on aortic rings’endothelium dependent contraction after formaldehyde is added(±s，n=6)

Tab 3Effect of NE on aortic rings’endothelium dependent contraction after formaldehyde is added(±s，n=6)

*P＜0.05 vs normal group;#P＜0.05 vs model group

Group Contraction of different NE concentration after formaldehyde is added/%10 －9mol·L－1 10 －8mol·L －1 10 －7mol·L －1 10 －6mol·L －1 10 －5mol·L －1 Control group 103.91 ±2.22 125.58 ±6.91 156.85 ±11.02 173.01 ±15.41 178.47 ±14.41 Model group 102.80 ±2.86 138.75 ±20.02 188.83 ±15.48* 202.21 ±15.78* 209.20 ±16.89*LP-L 104.77 ±2.22 127.29 ±16.46 172.21 ±8.43# 188.03 ±8.67# 192.97 ±11.78#LP-H 102.58 ±2.88 125.13 ±10.39 159.66 ±13.60# 178.01 ±13.06# 184.19 ±11.03#

Tab 4Effect of ACh on aortic rings＇endothelium dependent relaxation after methylamine is added(±s，n=6)

Tab 4Effect of ACh on aortic rings＇endothelium dependent relaxation after methylamine is added(±s，n=6)

*P＜0.05 vs normal group;#P＜0.05 vs model group

Group Relaxation of different ACh concentration after methylamine is added/%10 －8mol·L－1 10 －7mol·L －1 10 －6mol·L －1 10 －5mol·L －1 10 －4mol·L －1 Control group 10.13 ±7.15 28.63 ±7.13 48.64 ±13.83 79.73 ±9.16 94.43 ±11.18 Model group 7.32 ±6.34 13.98 ±10.08 29.09 ±15.20 55.92 ±8.51* 74.92 ±6.05*LP-L 5.15 ±5.57 13.16 ±6.42 24.71 ±15.02 56.65 ±12.26 85.94 ±8.43 LP-H 10.76 ±6.21 27.97 ±9.49 38.54 ±8.82 75.76 ±8.84# 95.25 ±8.42#

Tab 5Effect of NE on aortic rings’endothelium dependent contraction after methylamine is added(±s，n=6)

Tab 5Effect of NE on aortic rings’endothelium dependent contraction after methylamine is added(±s，n=6)

*P＜0.05 vs normal group;#P＜0.05 vs model group

Group Contraction of different NE concentration after methylamine is added/%10 －9mol·L－1 10 －8mol·L －1 10 －7mol·L －1 10 －6mol·L －1 10 －5mol·L －1 Control group 111.22 ±18.14 107.82 ±9.87 142.18 ±19.11 163.08 ±14.49 171.64 ±11.92 Model group 105.38 ±4.97 127.53 ±21.29 172.29 ±10.18* 193.71 ±10.76* 200.92 ±11.73*LP-L 11.021 ±8.61 126.80 ±8.62 168.69 ±11.24 189.02 ±5.07 195.76 ±3.01 LP-H 104.96 ±3.58 112.05 ±3.18 153.26 ±4.54# 164.44 ±4.59# 171.67 ±3.45#

H2O2是一種氧化活性強的過氧化物，在一定條件下可分解為一些氧化活性更強的氧自由基。這些氧自由基可以使VEC膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，破壞細胞的膜性系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，造成VEC功能障礙，分泌釋放的血管舒縮因子失調(diào)，影響血管的舒縮平衡。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2孵育后模型組的舒張反應(yīng)明顯降低，其原因可能是由于H2O2及其分解產(chǎn)物損傷VEC，引起VEC功能受損，從而使其合成分泌的舒血管因子減少，導(dǎo)致血管舒張減弱。實驗還發(fā)現(xiàn)，海帶多糖干預(yù)后血管環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)增高，提示海帶多糖對H2O2體外損傷VEC具有一定的保護功能。

甲醛是弱氧化劑，其作為一種自由基，進入細胞后使VEC發(fā)生脂質(zhì)過氧化的同時還抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性表達及NO的生理活性，并誘導(dǎo)表達誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，從而產(chǎn)生過量的病理性NO，加重脂質(zhì)過氧化程度，進一步導(dǎo)致VEC損傷［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，甲醛孵育后血管環(huán)的收縮反應(yīng)增強，同時低濃度的ACh使血管環(huán)的舒張效應(yīng)增高，這可能與甲醛誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的病理性NO有關(guān)。而海帶多糖孵育后血管環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)和收縮反應(yīng)均下降，提示海帶多糖可部分拮抗甲醛的損傷作用，保護VEC。

甲胺本身對VEC無直接毒性作用［7］，但甲胺可通過細胞膜進入VEC和血管平滑肌細胞，在氨基脲敏感胺氧化酶催化作用下生成甲醛、H2O2和氨［6］等毒性物質(zhì)，從而損傷VEC，影響血管的內(nèi)皮依賴性舒張和收縮功能。本研究發(fā)現(xiàn)，甲胺孵育后血管環(huán)的舒張效應(yīng)明顯降低，收縮效應(yīng)增高，而海帶多糖干預(yù)后，血管環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒縮功能均得到了改善，說明海帶多糖對甲胺誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒縮反應(yīng)具有一定的保護作用。

綜上所述，海帶多糖對腎上腺素代謝產(chǎn)物H2O2、甲醛和甲胺所致的血管內(nèi)皮依賴性舒縮功能的損傷具有一定的保護作用，其原因可能與海帶多糖的抗氧化作用有關(guān)［8］，其拮抗了這些代謝產(chǎn)物對VEC的氧化損傷，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮依賴性舒縮平衡。

［1］Yu D H，Lai C T，Zuo D M.Formation of formaldehyde from adrenalinein vivo;a potential risk factor for stress-related angiopathy［J］.Neurochem Res，1997，22(5):615－20.

［2］Harris K F，Matthews K A.Interactions between autonomic nervous system activity and endothelial function:A model for the development of cardiovascular disease［J］.Am Psychosom Soc，2004，66(2):153－64.

［3］黎 靜，謝 露，楊曉梅，等.海帶多糖對憤怒心理應(yīng)激大鼠血管舒縮功能影響的實驗研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27(5):638－41.

［3］Li J，Xie L，Yang X M，et al.Effect of laminaria polysaccharide on vascular relaxation and contraction of rats induced by psychological stress of anger［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):638－41.

［4］李 磊，戴 敏.動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮分泌失調(diào)與平滑肌細胞增殖［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(2):155－8.

［4］Li L，Dai M.The cause of atherosclerosis:secretory dysfunction in vascular endothelial cells and proliferation of smooth muscle cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(2):155－8.

［5］Izumi K，Akata T，Takahashi S.The action of sevoflurane on vascular smooth muscle of isolated mesenteric resistance arteries(Part 1):role of endothelium［J］.Anesthesiology，2000，92(5):1426－40.

［6］尹蔚蘭，讓蔚清.甲醛誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞的損傷作用及機制［D］.中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫，2005.

［6］Yi W L，Rang W Q.Injuring effect of formaldehyde on human umbilical vein endothelial cells and its machanism［D］.China Master’s Theses Full-text Database，2005.

［7］Yu P H，Zuo D M.Oxidative deamination of methylamine by semicarbazide-sensitive amine oxidase leads to cytotoxic damage in endothelial cells［J］.Diabetes，1993，42(4):594－603.

［8］梁桂寧，謝 露，胡世鳳，等.海帶多糖對應(yīng)激小鼠腎組織抗氧化能力的影響［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2006，22(18):2783－4.

［8］Liang G N，Xie L，Hu S F，et al.Effect of laminaria polysaccharide on the stress mice kidney tissues anti-oxidant ability［J］.Mod Med Health，2006，22(18):2783－4.