張玉玉， 宋 弋， 周婷婷， 呂 茜， 楊瑞學， 李全宏

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)機械化科學研究院，北京 100083)

高效液相色譜法測定鎮(zhèn)江香醋中5-羥甲基糠醛的含量

張玉玉1， 宋 弋1， 周婷婷1， 呂 茜1， 楊瑞學2， 李全宏1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)機械化科學研究院，北京 100083)

采用高效液相色譜法，對鎮(zhèn)江香醋中5－羥甲基糠醛進行了定量分析.樣品中的HMF含量的測定條件為:以甲醇－水溶液(體積比為5∶95)為流動相，流速為1.0 mL/min，采用Venusil XBPC18色譜柱分離，柱溫為30℃，UV檢測器的檢測波長為284 nm.定量分析結果表明，鎮(zhèn)江香醋中HMF的含量為8.01 mg/kg.高效液相色譜法分析鎮(zhèn)江香醋中HMF含量的方法測定準確，穩(wěn)定性高，HMF 在0.014 3 ～0.085 8 μg的進樣范圍內(nèi)線性相關系數(shù)為 R2=0.999 9，平均回收率98.66%，相對標準偏差為5.53%.

鎮(zhèn)江香醋;高效液相色譜;5－羥甲基糠醛;含量檢測

釀造食醋在我國有兩千多年的歷史［1］，是我國的傳統(tǒng)調(diào)味品，在飲食和保健方面都具有廣泛的應用.鎮(zhèn)江香醋作為釀造食醋的一種，具有“色、香、醇、酸、濃”的特點，為我國傳統(tǒng)名醋之一［2］，其香醋釀造技藝被列入首批“國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄”［3］.國標GB/T 18623—2002對鎮(zhèn)江香醋的定義是，以優(yōu)質(zhì)糯米為原料，采用傳統(tǒng)的復式糖化、酒精發(fā)酵和醋酸固態(tài)分層發(fā)酵工藝，經(jīng)陳釀釀制而成的香氣濃郁、酸而不澀的食醋［4］.鎮(zhèn)江香醋的香氣成分［5－7］和營養(yǎng)保健作用已經(jīng)得到了廣泛的研究，其具有降血壓、降血脂、消除疲勞、抗菌、防治感冒、抗氧化等作用［8－9］.

5－羥 甲 基 糠 醛 (5－h(huán)ydroxymethylfurfural，5－(hydroxymethyl)furan－2－carbaldehyde，HMF)，是葡萄糖或果糖等單糖化合物在高溫或酸性條件下，催化脫水產(chǎn)生的一種醛類化合物，是美拉德反應的重要中間產(chǎn)物［10］.5－羥甲基糠醛廣泛存在于酒類［11］、醬油［12］、蜂蜜［13］、烘焙食品［14］、醋［15］以及一些藥物中［16－17］.研究表明，一定劑量的糠醛或 HMF被機體吸收后，可引起動物橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害，并對眼黏膜、上呼吸道黏膜等產(chǎn)生刺激作用［18］.5－羥甲基糠醛含量的測定方法主要有高效液相色譜法［19］、氣相色譜質(zhì)譜法［20］、紫外比色法［21］.目前，利用高效液相色譜法，測定鎮(zhèn)江香醋中5－羥甲基糠醛含量的研究還未見報道.

本文采用高效液相色譜法，對鎮(zhèn)江香醋中的5－羥甲基糠醛進行定量分析，旨在建立一種準確測定鎮(zhèn)江香醋中5－羥甲基糠醛含量的方法，為鎮(zhèn)江香醋的生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎮(zhèn)江香醋，購于北京的超市.

5－羥甲基糠醛，純度99%，Sigma公司;甲醇，色譜純，北京愛希姆科技發(fā)展有限公司;水為超純水;0.45 μm水系濾膜，藍弋化工產(chǎn)品有限責任公司.

1.2 儀器與設備

LC－20A型高效液相色譜儀(配有LC－20AT型洗脫泵、SPD－20A型檢測器、CTO－20A型柱溫箱、LC Solution工作站)，島津國際貿(mào)易有限公司;Venusil XBP－C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，博納艾杰爾科技有限公司;LGJ－12型冷凍干燥機，北京松源華興科技公司;2000D型超純水器，北京長風儀器儀表公司.

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液的配制

精確稱取HMF標準品0.028 6 g，用超純水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，得0.286 mg/mL的HMF標準品儲備液，于4℃條件下避光保存.

1.3.2 樣品溶液的配制

準確稱取醋樣品71.710 0 g，－45℃冷凍干燥24 h，得5.280 7 g干燥醋樣品.取干燥醋樣品0.301 1 g，用超純水溶解并定容至 50 mL，0.45 μm 的水系微孔濾膜過濾后得測樣液，待HPLC分析.

1.3.3 分析測定條件

色譜條件為Venusil XBP－C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫為30℃;UV檢測器檢測波長為284 nm;流動相為5%甲醇，95%水(體積百分含量);流速為 1.0 mL/min;進樣量為 20 μL.

2 結果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

通過優(yōu)化流動相的比例，當流動相組分為甲醇－水(5∶95，V/V)，等梯度洗脫，流動相流速 1.0 mL/min，檢測波長284 nm時，HMF標準溶液的色譜峰圖形較好，見圖1.

圖1 HMF標準溶液液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of HMF standard solution

2.2 標準曲線和線性范圍

取0.286 mg/mL的HMF標準品儲備液1 mL，用超純水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，得2.86 μg/mL標準品溶液.取HMF標準品溶液(2.86 μg/mL)5，10，15，20，30 μL，注入液相色譜儀，依次經(jīng)優(yōu)化的高效液相色譜條件進行分析.以進樣量為橫坐標，以對應色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，見圖2，得到線性回歸方程:y=7 ×106x－704.57，R2=0.999 9.結果表明，進樣量在 5 ～30 μL(0.014 3 ～0.085 8 μg)的范圍內(nèi)，呈良好的線性關系.

圖2 5－羥甲基糠醛標準曲線Fig.2 Standard curve of 5－h(huán)ydroxymethylfurfural

2.3 重復性實驗

取測樣液，相同體積20 μL，進樣5次，分別按上述色譜條件測定其中HMF的含量，計算所測含量的相對標準偏差(RSD)為5.40%(見表1)，說明本方法用于測定鎮(zhèn)江香醋中5－HMF含量具有較好的重復性.

表1 重復性實驗結果Tab.1 Result of repeatability test

2.4 穩(wěn)定性實驗

取2.86 μg/mL的標準品溶液，室溫放置.每1.5 h進樣1次，測定5次，分別進樣20 μL.結果表明，所測含量的相對標準偏差(RSD)為2.83%(見表2)，說明處理后的標準溶液在室溫條件下6 h內(nèi)穩(wěn)定.

表2 穩(wěn)定性實驗結果Tab.2 Result of stability test

2.5 精密度實驗

在室溫條件下，取同一質(zhì)量濃度的HMF標準品溶液(2.86 μg/mL)，連續(xù) 5 次進樣，每次 20 μL，結果見表3.

表3 精密度實驗結果Tab.3 Result of precision test

表3結果表明，同樣濃度的標準品溶液連續(xù)進樣的相對標準偏差為0.27%，說明該方法的精密度較高.

2.6 加樣回收試驗

取已知含量的樣品約5 mL，共9份，分別加入濃度為 2.86 μg/mL HMF 的標準品溶液 0.8，1.0，1.2 mL.經(jīng)測定、計算得 HMF平均回收率為98.7%，RSD 為5.5%，結果見表 4.

表4 HMF加樣回收率試驗結果Tab.4 HMF recovery tests and corresponding relative standard deviations

Theobald等［15］采用高效液相色譜法，對未經(jīng)過前處理的醋樣品中HMF的含量進行了測定，其回收率范圍在95%～101%.

2.7 樣品測定

將鎮(zhèn)江香醋樣品，按1.3.2的既定實驗條件制備樣品溶液，用高效液相色譜測定HMF峰面積，液相色譜圖如圖3.

將測定的HMF峰面積代入回歸方程，計算鎮(zhèn)江香醋樣品中HMF的含量，為8.01 mg/kg.鎮(zhèn)江香醋中HMF含量的計算公式見式1.

式(1)中，y為峰面積，V1為稀釋體積，mL;V2為進樣體積，mL;m1為冷凍干燥后的質(zhì)量，g;m2為稀釋時取樣的質(zhì)量，g;m3為凍干前樣品的質(zhì)量，g;m為樣品中HMF的含量，mg/kg.Theobald等［15］分析了歐洲的7種醋中HMF的含量，發(fā)現(xiàn)醋樣品中的HMF含量從10 mg/L至3.3 g/L不等，認為焦糖化不是HMF的唯一生成途徑，HMF的含量可能與醋的儲藏時間有關.鎮(zhèn)江香醋樣品中HMF的含量為8.01 mg/kg，比Theobald等測定的歐洲7種醋樣品低.鎮(zhèn)江香醋的主要原料為優(yōu)質(zhì)糯米，在復式糖化、酒精發(fā)酵、醋酸固態(tài)分層發(fā)酵和陳釀的過程中，也會發(fā)生焦糖化和糖的脫水降解等反應，產(chǎn)生HMF.

圖3 鎮(zhèn)江香醋樣品中HMF的定量檢測液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of HMF determination in Zhenjiang vinegar

3 結論

運用高效液相色譜法檢測鎮(zhèn)江香醋中的HMF含量，選定的檢測條件為:流動相為甲醇－水溶液(體積比為 5∶95)，流速為 1.0 mL/min，分離色譜柱為Venusil XBP－C18，柱溫30℃，UV檢測器的檢測波長為284 nm.鎮(zhèn)江香醋中含有較多的低沸點揮發(fā)性成分，運用冷凍干燥法處理樣品，可以除去部分干擾HMF測定的成分，使得HMF含量的液相色譜定量測定方法準確度、精密度均較好，重現(xiàn)性良好，在0.014 3 ～0.085 8 μg的進樣范圍內(nèi)線性相關系數(shù)為R2=0.999 9，平均回收率98.66%，相對標準偏差為5.53%.定量分析結果表明，鎮(zhèn)江香醋中HMF的含量為8.01 mg/kg.鎮(zhèn)江香醋中HMF含量的測定結果表明，與歐洲的醋樣品相比，鎮(zhèn)江香醋中的HMF含量相對較低.

［1］趙謀明.調(diào)味品［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2001:88－89.

［2］曹雁平.食品調(diào)味技術［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2002:141－148.

［3］余永建，張叔萍，趙順華，等.利用紅曲菌及植物乳酸桿菌生產(chǎn)功能性鎮(zhèn)江香醋工藝的研究［J］.中國調(diào)味品，2010(12):68－70.

［4］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 18623—2002鎮(zhèn)江香醋［S］.北京:中國標準出版社，2003.

［5］孫宗保，趙杰文，鄒小波，等.鎮(zhèn)江香醋特征香氣成分加工過程中的變化和形成機理分析［J］.中國食品學報，2010，10(3):120－127.

［6］孫宗保，趙杰文，鄒小波，等.鎮(zhèn)江香醋加工過程中理化指標分析及其與香氣成分關系初探［J］.食品科學，2009，30(9):59－61.

［7］孫宗保，鄒小波，趙杰文.幾種中國傳統(tǒng)名醋揮發(fā)性風味成分的比較研究［J］.中國調(diào)味品，2010，35(9):34－41.

［8］徐清萍，陶文沂，敖宗華.鎮(zhèn)江香醋抗氧化活性成分來源分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(3):33－36.

［9］沈志遠.鎮(zhèn)江香醋的營養(yǎng)保健和藥用功能研究［J］.食品科學，2005，26(8):483－485.

［10］Hodge J E.Dehydrated Foods:Chemistry of browning reactions in model systems［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1953，1(15):928－943.

［11］Chen L，Huang H，Liu W，et al.Kinetics of the 5－h(huán)ydroxymenthylfurfural formation reaction in Chinese rice wine［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(6):3507－3511.

［12］王妙飛，張水華，郭新東，等.高效液相色譜法測定醬油中的5－羥甲基糠醛［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24(2):188－190.

［13］Ajlouni S，Sujirapinyokul P.Hydroxymenthylfurfuraldehyde and amylase contents in Australian honey［J］.Food Chemistry，2010，119(3):1000－1005.

［14］Akp?nar K，Karaka? B，Ak?a H，et al.Determination of HMF in roasted flour/oil mixtures and effect of solvent used in the extraction procedure ［J］.Food Chemistry，2011，128(3):790－794.

［15］Theobald A，Müller A，Anklam E.Determination of 5－h(huán)ydroxymethylfurfural in vinegar samples by HPLC［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(5):1850－1854.

［16］馬長海.奧扎格雷鈉葡萄糖注射液中5－羥甲基糠醛的 RP－HPLC 測定 ［J］.中國醫(yī)藥指南，2009，7(14):21－22.

［17］王蘭，徐春明.反相色譜法測定葡萄糖注射液中5－羥甲基糠醛的含量［J］.中國醫(yī)療前沿，2009，4(13):113－114.

［18］譚俊杰，柴建國，張善飛，等.參麥注射液中5－羥甲基糠醛含量的高效液相色譜測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(7):1624－1625.

［19］Spano N，Casula L，Panzanelli A，et al.An RP－HPLC determination of 5－h(huán)ydroxymethylfurfural in honey:The case of strawberry tree honey［J］.Talanta，2006，68(4):1390－1395.

［20］Gaspar E M，Lopes J F.Simple gas chromatographic method for furfural analysis［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216(14):2762－2767.

［21］張翠，柴欣生，羅小林，等.紫外光譜法快速測定生物質(zhì)提取液中的糠醛和羥甲基糠醛［J］.光譜學與光譜分析，2010，30(1):247－250.

(責任編輯:李 寧)

Determination of 5-hydroxymethylfurfural in Zhenjiang Vinegar by HPLC

ZHANG Yu－yu1， SONG Yi1， ZHOU Ting－ting1， Lü Qian1， YANG Rui－xue2， LI Quan－h(huán)ong1
(1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.Chinese Academy of Agricultural Mechanization Science，Beijing 100083，China)

A method for determination of 5－h(huán)ydroxymethylfurfural by high－performance liquid chromatography in Zhenjiang vinegar was developed.Samples were analyzed on a Venusil XBP－C18 column with oven temperature of 30℃，using a mixture of methanol and water(5∶95，v/v)as the mobile phase with the flow rate of 1.0 mL/min，and detected at 284 nm.Within the linear range of 0.014 3 ～0.085 8 μg，the correlation coefficient was 0.999 9.The method was accurate with the average recoveries rate and relative standard deviation of 98.66%and 5.53%，respectively.

Zhenjiang vinegar;high－performance liquid chromatographic;5－h(huán)ydroxymethylfurfural;content determination

TS264.2

A

1671－1513(2012)02－0039－04

2011－07－11

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2011BAD23B01).

張玉玉，女，博士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學;

李全宏，男，教授，博士，博士生導師，主要從事天然產(chǎn)物化學及農(nóng)產(chǎn)品綜合利用方面的研究.通訊作者.