管 明 徐婭蘋

感音神經(jīng)性耳聾患者在臨床上多見，約占總?cè)丝诘?0%。主要是因為衰老、噪聲、耳毒性藥物、外傷、感染、腫瘤、遺傳、免疫等體內(nèi)外因素所致，且哺乳動物耳蝸毛細胞破壞后再生能力有限，常引起不可逆性的聽力下降，治療困難。隨著內(nèi)耳發(fā)育機制研究的深入和干細胞組織工程技術(shù)的逐漸成熟，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)許多因子，如EGF、FGF、TGF－α、甲狀腺素等在內(nèi)耳毛細胞、支持細胞的分化、成熟、再生中起作用，試圖通過加入這些活性因子促進毛細胞再生，或誘導(dǎo)干細胞分化為毛細胞來治療感音神經(jīng)性耳聾。維甲酸(RA)作為維生素A的活性衍生物，在許多器官的發(fā)育中必不可少。同樣，RA在胚胎期內(nèi)耳發(fā)育和出生后內(nèi)耳功能維持中起關(guān)鍵作用。本文就維甲酸合成酶、維甲酸分解酶，維甲酸受體在內(nèi)耳中的特異性表達及維甲酸在內(nèi)耳發(fā)育中的作用及其機制做綜述。

一、維甲酸的代謝及維甲酸合成酶和分解酶在內(nèi)耳的分布

1．維甲酸的代謝:在細胞內(nèi)，維生素A與維生素A結(jié)合蛋白(CRBP)緊密結(jié)合后，首先，在酒精脫氫酶家族(ADH家族)的作用下，維生素A氧化成視黃醛;接著，視黃醛在視黃醛脫氫酶(RALDHs，又稱RA合成酶，包括 RALDH1、RALDH2、RALDH3、RALDH4)的作用下，視黃醛氧化成全反式維甲酸(ATRA)和9－cis維甲酸(9－cisRA)［1］。而在細胞色素 P450超家族成員CYP26(又稱RA分解酶:包括CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1)的作用下，RA被代謝分解。RA在內(nèi)耳的特定時間、特定部位的表達是通過RALDHs和CYP26來調(diào)控的，所以了解RALDHs和CYP26在內(nèi)耳的表達有助于我們理解RA在內(nèi)耳發(fā)育過程中的作用。

2．RA合成酶在內(nèi)耳的表達:RALDH1、RALDH2、RALDH3存在于胚胎第9．5～10天(E9．5～10)的聽泡中。在 E10．5，RALDH1、2、3表達局限于聽泡上皮。其中RALDH1表達范圍最廣，表達在內(nèi)淋巴管原基和聽泡上皮腹外側(cè);RALDH2僅表達于聽泡上皮側(cè)面;RALDH3表達于聽泡上皮腹側(cè)和中間區(qū)。在所有 RALDH中，RALDH2在此期表達量最高。在E12.5，RALDH1、2、3 存在于將發(fā)育為前庭、耳蝸上皮的聽泡上皮區(qū)，另外RALDH1、2還存在于內(nèi)淋巴管上皮中。在E14．5，RALDH1存在于半規(guī)管上皮、內(nèi)淋巴管、壺腹嵴;RALDH2存在于前庭鄰近壺腹嵴的上皮區(qū)及耳蝸非感覺上皮區(qū)。在E18．5，RALDH1局限于前庭球囊、橢圓囊和嵴的一些區(qū)域及耳蝸柯替氏器。RALDH2局限于耳蝸血管紋、前庭膜及前庭鄰近壺腹嵴的上皮區(qū)。而在 E14．5、E18．5，RALDH3 均表達于半規(guī)管、壺腹嵴、球囊、橢圓囊的感覺上皮區(qū)及耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)［2］。

3．RA 分解酶在內(nèi)耳的表達:在 E9．5，CYP26A1已存在于聽泡上皮側(cè)面和腹側(cè)，及其周圍間質(zhì)。在E10．5，CYP26A1局限于聽泡上皮的腹側(cè)，但在周圍間質(zhì)腹側(cè)、中間區(qū)、側(cè)面表達豐富;CYP26B1表達局限于聽泡上皮側(cè)面和中間區(qū);CYP26C1存在于聽泡上皮腹側(cè)和間質(zhì)區(qū)。在E12．5，CYP26A1表達在聽泡上皮腹側(cè)、側(cè)面，及圍繞后半規(guī)管的間質(zhì)區(qū);CYP26B1表達在聽泡間質(zhì)的腹側(cè)及圍繞水平半規(guī)管的間質(zhì)區(qū)，并存在于將發(fā)育為前庭、耳蝸感覺上皮的聽泡上皮區(qū)。隨著胚胎發(fā)育，CYP26A1表達下降，在E14．5局限于耳蝸和球囊，在E18．5未發(fā)現(xiàn)有表達。相反，CYP26B1在 E14．5、E18．5 的耳蝸、前庭感覺上皮有高水平表達，在出生后開始下降。CYP26C1在E10．5～E12．5的聽泡上皮腹側(cè)和鄰近間質(zhì)表達［3］。

如上所述，在胚胎發(fā)育的不同時期，RA合成酶(RALDHs)和RA分解酶(CYP26)在內(nèi)耳的表達部位不同，從而協(xié)調(diào)RA在內(nèi)耳的表達，這是內(nèi)耳發(fā)育所必須的。Frenz等［4］研究發(fā)現(xiàn)RA過量和不足都將導(dǎo)致內(nèi)耳發(fā)育的畸形。

二、維甲酸受體在內(nèi)耳的分布

維甲酸是通過結(jié)合于細胞核內(nèi)特異性受體，調(diào)節(jié)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮作用的，維甲酸受體(retinoic acid receptors)的變異和缺失將引起內(nèi)耳發(fā)育畸形。維甲酸受體屬于細胞核受體中類固醇/甲狀腺素激素超家族成員，分為兩類:RARs和RXRs。RARs能被全反式維甲酸和9－cis維甲酸激活，而RXRs僅能被9－cis維甲酸激活。RARs可分為:RARα、RARβ、RARγ;而 RXRs包含 RXRα、RXRβ、RXRγ。每一種RARs又能和任何一種RXRs在體內(nèi)外形成異二聚體。結(jié)合了維甲酸的RARs、RXRs、RARs/RXRs異二聚體通過RA反應(yīng)元件(RAREs)作用于許多目標(biāo)基因，轉(zhuǎn)錄功能蛋白，發(fā)揮生物活性作用。RA受體在轉(zhuǎn)導(dǎo)RA信號上是必須的，了解RA受體在內(nèi)耳的表達有助于我們了解RA在內(nèi)耳發(fā)育中的作用。

在 E10．5，RARβ、RARγ 主要位于將發(fā)育成內(nèi)淋巴管的聽泡上皮周圍間質(zhì)細胞上。在E12．5，RARα位于聽泡上皮大部分區(qū)域和鄰近間質(zhì)區(qū)域;RARβ主要位于聽泡上皮中間區(qū)和鄰近的間質(zhì)上;RARγ局限表達在聽泡周圍間質(zhì)上;RXRα在除了將發(fā)育為內(nèi)淋巴管的聽泡上皮沒有表達外，在聽泡上皮和周圍間質(zhì)廣泛表達;RXRβ在聽泡上皮廣泛表達，還表達在周圍間質(zhì)側(cè)面和中間區(qū)，但在腹側(cè)沒有表達;RXRγ局限于聽泡上皮的特殊區(qū)域。在 E18．5，RARα、RARγ、RXRα、RXRβ 分布在耳蝸幾個區(qū)域，相反RARβ、RXRγ局限于蝸軸和基膜。

如上所述，維甲酸受體在胚胎內(nèi)耳的表達部位是特殊的，同樣在胚胎內(nèi)耳的發(fā)育中起著不同的作用。Romand等［2］提出聽泡中央部位的感覺上皮RA信號的傳導(dǎo)主要依靠RARα和3種RXR，其最終發(fā)育形成耳蝸和球囊，而RARγ和RXRα主要在軟骨性耳囊(otic capsule)成形過程中起轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的作用。

三、維甲酸在軟骨性耳囊發(fā)育中的作用

1977年，Lim首次提出RA在軟骨性耳囊中的作用，接著RA在軟骨性耳囊發(fā)育中的作用和作用途徑得到了進一步的闡述。1996年，F(xiàn)renz報道在胚胎發(fā)育的特殊時期，暴露于過多的外界ATRA下會使軟骨性耳囊畸形發(fā)育。1998年，Underhill和Weston闡述RARS基因不適當(dāng)?shù)谋磉_將抑制軟骨性耳囊發(fā)育。2002年，Romand等［2］更加詳細的闡述了RA在軟骨性耳囊發(fā)育中的作用，并發(fā)現(xiàn)RARα和RARγ是RA調(diào)節(jié)內(nèi)耳軟骨性耳囊發(fā)育的受體。因為 RARα、RARβ、RARγ 基因單獨缺失突變和 RARα/RARβ、RARβ/RARγ基因無效突變，并不產(chǎn)生內(nèi)耳畸變，但RARα/RARγ基因無效突變，將產(chǎn)生嚴重的內(nèi)耳畸變。主要表現(xiàn)在:①到胚胎第10．5天，聽泡的大小只有正常的一半;②內(nèi)淋巴管缺失;③到E14，半規(guī)管發(fā)育停止。

RA在軟骨性耳囊發(fā)育中的作用途徑:軟骨性耳囊發(fā)育的早期，兩條信號起了重要作用。①聽泡上皮與周圍間質(zhì)之間的相互作用。La Mantia等［5］闡述在聽泡發(fā)育的早期，間質(zhì)和上皮之間的相互作用包含多條途徑，而RA是上皮和間質(zhì)之間相互作用的途徑之一;②菱腦神經(jīng)組織與聽泡外胚層之間的作用。Mc－caffery等［6］報道菱腦神經(jīng)組織和聽泡外胚層之間的相互作用包含多種因子，而RA是其中的一種。如上所述，RA在軟骨性耳囊發(fā)育的兩條途徑中都發(fā)揮了重要作用。

四、維甲酸在耳蝸毛細胞分化成熟中的作用

1．維甲酸在毛細胞分化和再生中的作用:①在生理條件下，RA存在于成年哺乳動物前庭上皮、鳥類前庭上皮和耳蝸血管紋上，而在成年哺乳動物耳蝸上沒有發(fā)現(xiàn)RA的存在;相應(yīng)的，成年哺乳動物前庭上皮和成年鳥類所有上皮均能再生，而成年哺乳動物耳蝸感覺上皮在無外加誘導(dǎo)條件的作用下不能再生，說明RA可能在內(nèi)耳感覺上皮的發(fā)育中起作用;②在體外培養(yǎng)條件下，外源性RA的加入能促進毛細胞分化和再生。例如將小鳥聽泡體外培養(yǎng)，加入RA后，引起毛細胞分化的提早和毛細胞數(shù)量的增加;新生大鼠耳蝸柯替氏器體外培養(yǎng)中，加入新霉素破壞耳蝸毛細胞，再加入RA后，可誘導(dǎo)毛細胞再生。

2．維甲酸促進毛細胞分化和再生的作用途徑:在Raz的實驗中，RA加入到胚胎柯替氏器培養(yǎng)體系中，誘導(dǎo)產(chǎn)生額外數(shù)量的毛細胞和支持細胞，這些額外數(shù)量的毛細胞和支持細胞并不是通過促使原有毛細胞和支持細胞有絲分裂產(chǎn)生的，所以RA的作用不是促進細胞的有絲分裂［7］。Raz認為RA的作用在于誘導(dǎo)內(nèi)耳干細胞分化為內(nèi)耳感覺前體細胞，然后內(nèi)耳感覺前體細胞在細胞與細胞相互作用機制下發(fā)育成毛細胞或支持細胞。

五、維甲酸在內(nèi)耳發(fā)育中所涉及的相關(guān)因子

1．HOXa－1基因:RARβ/RARγ基因無效突變引起的發(fā)育不全類似于HOXa－1基因缺失，將致大部分耳蝸結(jié)構(gòu)如聽覺毛細胞、螺旋神經(jīng)元均缺失。而且HOXa－1啟動子上擁有維甲酸反應(yīng)元件(RAREs)，RA調(diào)節(jié)HOXa－1RNA的轉(zhuǎn)錄。所以HOXa－1基因接受RA的調(diào)節(jié)，對內(nèi)耳的發(fā)育起作用。

2．FGF3基因:由中胚層和聽泡鄰近的神經(jīng)組織分泌的FGF3是聽泡發(fā)育的主要誘導(dǎo)因子，而RA和FGF3之間關(guān)系密切:①在Phillips體外培養(yǎng)實驗中，RA誘導(dǎo)形成異位或額外數(shù)量聽泡的作用，是通過誘導(dǎo)FGF3表達增加實現(xiàn)的，且拮抗FGF3即阻斷外源性RA的作用，不形成異位或額外數(shù)量聽泡;②在小鼠，RALDH2無效突變將引起FGF3表達下降和表達失控;③Wendling的實驗發(fā)現(xiàn) RARα/RARβ、RARα/RARγ無效突變的小鼠胚胎和維生素A缺乏的大鼠胚胎中，F(xiàn)GF3異位表達，并出現(xiàn)額外的小聽泡;④Liu的研究結(jié)果顯示，過量的RA將破壞FGF3信號通路，致內(nèi)耳發(fā)育畸形［8～11］。所有這些實驗都證實了FGF3在RA誘導(dǎo)聽泡發(fā)育過程中起作用。

3．BMP基因:BMP基因是TGF超家族成員，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)14類BMP基因。BMP4在聽泡上皮和臨近周圍間質(zhì)中表達，是聽泡軟骨發(fā)育和毛細胞分化的調(diào)節(jié)因子。BMP4基因擁有RA反應(yīng)元件，接受RA的直接調(diào)節(jié)，而且RA的作用是抑制聽泡BMP4表達的。

4．Shh基因:Shh無效突變，產(chǎn)生內(nèi)耳，尤其是耳蝸畸變，類似于RARα/RARγ無效突變引起的內(nèi)耳畸形。而且Shh基因啟動子上有RA反應(yīng)元件，所以Shh基因接受RA的調(diào)節(jié)，對內(nèi)耳的發(fā)育起作用。

5．TGF－β基因:TGF超家族成員之一，包括TGF－β1和TGF－β2。TGF－β在聽泡上皮上表達;Butts的研究發(fā)現(xiàn):在體外培養(yǎng)中，加入致畸水平的RA，將使TGF－β表達下降，從而抑制軟骨發(fā)育，影響感覺上皮分化。

6．OTX1和OTX2基因:OTX1和OTX2是RA可能的下游作用因子。在聽泡中表達，對半規(guī)管和耳蝸的形成起作用。在鼠胚胎期內(nèi)耳中，OTX2的表達對RA的濃度高度敏感。

7．其他:McCaffery等［6］報道一些生長因子同樣受RA調(diào)節(jié)，包括NT－3、BDNF。它們在聽泡中表達，是位聽神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元存活所必需的。

綜上所述，維甲酸合成酶、維甲酸分解酶、維甲酸受體、維甲酸在內(nèi)耳有著特異性協(xié)調(diào)表達，維甲酸在內(nèi)耳聽泡軟骨和內(nèi)耳感覺上皮細胞分化中起作用，是聽泡形成和內(nèi)耳感覺上皮細胞分化的重要條件之一。盡管我們例舉了在內(nèi)耳發(fā)育中與維甲酸有關(guān)的許多因子，但是究竟是哪些因子在其中起著最為重要的作用，以及他們相互之間關(guān)系還有待進一步闡明。

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