段 莉，林典岳，鄭根建

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，海南醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，海南?？?71101)

骨免疫學(xué)是研究骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互作用的一門(mén)學(xué)科。免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)兩者間的相互作用參與調(diào)控骨改建的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。免疫細(xì)胞活性異常和破骨細(xì)胞過(guò)度活躍是引起炎癥性牙槽骨吸收的病理基礎(chǔ)。Notch信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控骨髓、胸腺前體細(xì)胞的分化方向，在破骨細(xì)胞分化和免疫細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。本文在分析Notch信號(hào)通路組成和結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，綜合最新進(jìn)展，就Notch信號(hào)通路對(duì)骨免疫的調(diào)控機(jī)制及其在牙周炎發(fā)生中的可能作用作一綜述。

1 Notch信號(hào)通路

Notch基因于1917年在果蠅(drosophila)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，因其部分功能喪失導(dǎo)致果蠅翅緣缺口(notch)而得名。Notch信號(hào)途徑是通過(guò)局部細(xì)胞間的相互作用以控制細(xì)胞命運(yùn)的一種途徑。從線蟲(chóng)到人類的幾乎所有被研究過(guò)的生物中，Notch信號(hào)途徑從結(jié)構(gòu)到功能都是保守的，而且在發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的調(diào)控作用［1］。Notch信號(hào)途徑由Notch受體、配體以及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和核內(nèi)應(yīng)答因子組成。

哺乳動(dòng)物Notch受體包括4個(gè)同源體(Notch1－4)，由胞外區(qū)域(the extracellular domain of Notch，NECD)、跨膜區(qū)域(transmembrane domain，TM)和胞內(nèi)區(qū)域(the intracellular domain of Notch，NICD)組成。Notch配體共有5種，:Jagged家族(Jagged 1，Jagged 2)和Delta－like家族(Delta 1、Delta 3和Delta 4)兩個(gè)家族。新合成的Notch前體需被蛋白質(zhì)水解切割后才具有活性。Notch前體首先被高爾基體內(nèi)的Furin－like蛋白酶進(jìn)行S1位點(diǎn)切割為2個(gè)片段，再通過(guò)鈣依賴性非共價(jià)鍵結(jié)合形成異二聚體，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，形成跨膜蛋白。當(dāng)配體結(jié)合到 Notch胞外區(qū)(NECD)，腫瘤壞死因子－α－轉(zhuǎn)化酶(TNF－α converting enzyme，TACE)在Notch受體的S2位點(diǎn)進(jìn)行切割，釋放出胞外部分，留下與膜粘連的胞內(nèi)部分(Notch－intra T M)。在跨膜區(qū)S3位點(diǎn)被早老蛋白(presenilin，PS)依賴的 γ－分泌酶(γ－secretase)切割釋放Notch胞內(nèi)片段(NICD，Notch的活性形式)，NICD不經(jīng)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用而直接進(jìn)入細(xì)胞核，與 DNA結(jié)合蛋白R(shí)BP－J相互作用。NICD不在核內(nèi)時(shí)，RBP－J與其他抑制因子(Co－R)結(jié)合形成為轉(zhuǎn)錄抑制因子復(fù)合體。當(dāng)胞內(nèi)區(qū)和其他活化因子(Co－A)結(jié)合時(shí)，RBP－J能促進(jìn)靶基因如HES和HERP的表達(dá)［2］。已有研究表明，Notch信號(hào)不但通過(guò)影響B(tài)和T淋巴細(xì)胞的發(fā)育參與調(diào)控免疫應(yīng)答過(guò)程［3－4］，而且還參與調(diào)控骨改建過(guò)程［5］。

2 骨免疫學(xué)

骨免疫學(xué)是研究骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互作用的一門(mén)學(xué)科［6］。骨形成和骨吸收之間的平衡調(diào)節(jié)著骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，主要通過(guò)成骨細(xì)胞(Osteoblasts，OB)和破骨細(xì)胞(Osteclasts，OC)間的相互協(xié)調(diào)作用。盡管破骨細(xì)胞是骨吸收的主要功能細(xì)胞，但其本身又受到局部微環(huán)境調(diào)節(jié)［7］。免疫功能異常將影響骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，T細(xì)胞異?；罨瘯?huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞過(guò)度活躍，從而使骨吸收速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)骨形成速度，是牙周炎(periodontitis)發(fā)生的病理學(xué)基礎(chǔ)［8－9］。此外，免疫系統(tǒng)異常亦與骨質(zhì)疏松的發(fā)生有著緊密聯(lián)系［10］。因此，免疫系統(tǒng)與骨骼系統(tǒng)兩者間的相互作用受到密切關(guān)注。

2.1 破骨細(xì)胞

破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞，是高度分化的多核巨細(xì)胞，直接參與骨吸收。一方面，破骨細(xì)胞過(guò)度活躍是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)和牙周炎發(fā)生的病理學(xué)基礎(chǔ)［9，11］;另一方面，破骨細(xì)胞活性低下又可引發(fā)骨質(zhì)硬化癥(osteopetrosis)［12］。因此，如何調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性是骨免疫研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。免疫細(xì)胞、骨髓微環(huán)境中的成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞均參與調(diào)控破骨細(xì)胞的分化及其骨吸收功能［13－14］。核因子－κB受體活化因子(receptor activator of NF－κB，RANK)及其配體 RANKL和誘餌受體骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)是破骨細(xì)胞發(fā)育和功能活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［15］。RANKL－RANK信號(hào)傳導(dǎo)可以激活破骨細(xì)胞發(fā)育所需的一系列下游信號(hào)途徑，但OPG能競(jìng)爭(zhēng)性地與 RANKL結(jié)合，阻斷 RANK與RANKL間的相互作用，從而抑制破骨細(xì)胞的形成和活化［16］。

2.2 B細(xì)胞、T細(xì)胞與破骨細(xì)胞的關(guān)系

B細(xì)胞和T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答(adaptive immune system)中參與識(shí)別和抵御外來(lái)病原物的主要成員。有研究發(fā)現(xiàn)，缺乏B細(xì)胞的老鼠會(huì)發(fā)生骨質(zhì)疏松，提示免疫細(xì)胞參與維持基礎(chǔ)水平的骨代謝平衡［17］;成熟B細(xì)胞分泌的OPG量占整個(gè)骨髓來(lái)源的50%以上，因此對(duì)生理狀態(tài)下的破骨細(xì)胞活性起到明顯的抑制作用［18］。從牙周病變部位分離培養(yǎng)的包括T細(xì)胞和B細(xì)胞在內(nèi)的單核細(xì)胞能誘導(dǎo)體外的破骨細(xì)胞分化［19］。上述研究結(jié)果提示，T細(xì)胞和B細(xì)胞主要是通過(guò)調(diào)控RANKL的表達(dá)水平，從而影響破骨細(xì)胞分化及其骨吸收能力。

T細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)效應(yīng)取決于T細(xì)胞分泌的促進(jìn)和抑制因子。一方面，活化的T細(xì)胞所產(chǎn)生的RANKL通過(guò)與破骨前體細(xì)胞的RANK直接結(jié)合，而誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化［20－21］。另一方面，由T細(xì)胞分泌的γ－干擾素(IFN－γ)能在極其微量的濃度時(shí)通過(guò)激活泛素/蛋白酶(ubiquitin/ proteasome)降解腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子－6 (tumor necrosis factor receptor－associated factor－6，TRAF－6)，從而抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化效應(yīng)［22－23］。此外，CD4+輔助性T細(xì)胞(T helper，Th)按其所產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同分為T(mén)h 1和Th 2，Th 1主要產(chǎn)生IFN－γ，而Th 2主要產(chǎn)生白介素－4， 5和10(interleukin，IL)［24］。除上述IFN－γ能抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化外，IL－10也能通過(guò)降低活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT－c1)的表達(dá)水平及核轉(zhuǎn)位能力而抑制破骨細(xì)胞分化［25－26］。在上述負(fù)性調(diào)控因子存在的關(guān)節(jié)炎癥病變部位，活化的CD4+T細(xì)胞是如何誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的呢?有學(xué)者推測(cè)，可能存在一類非常微量但對(duì)病理性骨吸收起著極其重要作用的Th細(xì)胞，稱為破骨細(xì)胞源性輔助T細(xì)胞(osteoclastogenic Th，ThOc)［27］。目前，已經(jīng)明確 ThOc是一類能產(chǎn)生IL－17的CD4+T細(xì)胞，其中Th 1和Th 2具有抑制破骨細(xì)胞分化的效應(yīng)［28］。進(jìn)一步研究表明，IL－17A對(duì)生理性骨改建過(guò)程沒(méi)有影響，但在炎癥狀態(tài)下，能通過(guò)上調(diào)破骨前體細(xì)胞RANK表達(dá)水平，提高RANK對(duì)RANKL的敏感性，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及其骨吸收，從而在病理性骨改建過(guò)程中發(fā)揮重要作用［29］。

目前有關(guān)破骨細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)控效應(yīng)尚不明確。破骨細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞(antigen－presenting cells，APCs)為活化T細(xì)胞。與樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)類似，破骨細(xì)胞主要表達(dá)組織相容性抗原Ⅰ和Ⅱ(major histocompatibility complex，MHC)、CD80、CD86和CD40;并能吸收攝取可溶性抗原。同時(shí)，破骨細(xì)胞還能分泌IL－10、IL－6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β (transforming growth factor－beta，TGF－β)和腫瘤壞死因子－α(tumor necrosis factor－alpha，TNF－α)，并以MHC受限的方式呈遞外來(lái)抗原而活化CD4+和CD8+同種異體反應(yīng)性 T細(xì)胞 (alloreactive Tcells)［30］。

3 Notch信號(hào)通路與破骨細(xì)胞的關(guān)系

定向敲除小鼠成骨細(xì)胞的早老素－1(presenilin－1)和早老素－2，可導(dǎo)致OPG水平降低、破骨細(xì)胞活性增高從而降低小鼠的骨質(zhì)密度［31］，提示Notch信號(hào)可通過(guò)降低OPG的表達(dá)水平，以非細(xì)胞自主方式(a non－cell autonomous manner)調(diào)控破骨細(xì)胞的形成。體外實(shí)驗(yàn)表明，Notch 1信號(hào)和Notch 2信號(hào)亦均以細(xì)胞自主方式(a cell autonomous manner)調(diào)控破骨細(xì)胞的分化過(guò)程，抑制破骨前體細(xì)胞Notch 1信號(hào)能促進(jìn)其向破骨細(xì)胞分化［32］。利用γ－分泌酶抑制劑阻斷 Notch信號(hào)或通過(guò)shRNA干擾阻斷Notch 2信號(hào)均能抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過(guò)程;而活化Notch 2信號(hào)則能促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過(guò)程［33］。因此，兩種細(xì)胞方式(自主或非自主)均參與Notch信號(hào)對(duì)破骨細(xì)胞分化的調(diào)控過(guò)程。由于破骨前體細(xì)胞主要表達(dá)Notch 2受體［34］，提示Notch信號(hào)的綜合效應(yīng)可能是一種正向調(diào)控破骨細(xì)胞分化過(guò)程。

4 Notch信號(hào)通路與免疫細(xì)胞的關(guān)系

4.1 Notch信號(hào)與邊緣帶B細(xì)胞發(fā)育

成熟的外周B細(xì)胞主要包括濾泡B細(xì)胞(Follicular B)和邊緣帶B細(xì)胞(marginal zone B，MZB)兩個(gè)亞類。MZB細(xì)胞主要啟動(dòng)體液免疫以清除外來(lái)抗原［34］。初始B細(xì)胞(naive B cell)主要表達(dá)Notch 2受體35－36］，Notch 2或Dll 1基因敲除鼠體內(nèi)的 MZB細(xì)胞數(shù)量明顯減少［35，37］，提示Notch 2信號(hào)途徑在MZB細(xì)胞的發(fā)育中起決定作用。敲除 Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子RBP－J［38］或MAML 1(mastermind－like 1)［39］基因后，小鼠亦不能產(chǎn)生MZB細(xì)胞，進(jìn)一步表明Notch信號(hào)途徑在MZB細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵作用。交互實(shí)驗(yàn)(reciprocal experiment)結(jié)果顯示，敲除 MINT (Notch/RBP－J信號(hào)通路的抑制因子)基因后，小鼠MZB細(xì)胞數(shù)量劇增，同時(shí)伴隨濾泡B細(xì)胞數(shù)量下降［40］。上述基因功能喪失實(shí)驗(yàn)表明，Notch 2與Dll 1的相互作用參與調(diào)控MZB的發(fā)育過(guò)程。

4.2 Notch信號(hào)與Th 1的關(guān)系

Th 1細(xì)胞主要分泌IFN－γ，參與細(xì)胞免疫和遲發(fā)型超敏性炎癥的形成［41］。DC細(xì)胞通過(guò)表達(dá)Notch的不同配體與T細(xì)胞發(fā)生互相作用而影響Th向Th 1或Th2分化;其中Delta誘導(dǎo)Th向Th1分化，而Jagged誘導(dǎo)其向Th 2分化［42］。即Delta配體高表達(dá)時(shí)促進(jìn)Th向Th 1分化，而被抑制時(shí)則向Th 2細(xì)胞分化［43］。此外，使用γ－分泌酶抑制劑能阻斷Th 1發(fā)育過(guò)程，表明Notch信號(hào)對(duì)Th 1細(xì)胞發(fā)育具有重要的調(diào)控作用［44］。轉(zhuǎn)錄因子T－bet(Notch靶基因之一)參與Dll誘導(dǎo)Th 1細(xì)胞分化過(guò)程，但不參與Dll對(duì)Th 2細(xì)胞分化的抑制過(guò)程［45］。阻斷Dll 4－Notch途徑后，CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)數(shù)量增加，Th 2/Th 1–Th 17比值升高，能減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的臨床癥狀和中樞系統(tǒng)炎癥反應(yīng)［46］。

目前，有關(guān)參與Dll誘導(dǎo)Th 1極化的Notch受體尚不清楚。CD4+T細(xì)胞主要表達(dá) Notch 1和 Notch 3受體［43］，過(guò)表達(dá)N3－ICD激活Notch 3信號(hào)能促進(jìn)Th向Th 1細(xì)胞分化，同時(shí)提高IFN－γ表達(dá)水平;但過(guò)表達(dá)N1－ICD激活的Notch 1信號(hào)通路并不影響IFN－γ的表達(dá)。交互試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使Delta 1－Fc存在，一旦失活Notch 3受體阻斷Notch 3信號(hào)通路，Th1細(xì)胞分化過(guò)程仍然受阻，表明Notch 3－Delta的相互作用在Th 1極化中發(fā)揮重要作用［43］。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，通過(guò)阻斷Notch 3信號(hào)途徑能抑制Th 1細(xì)胞免疫反應(yīng)［47］。另一方面，有證據(jù)表明Notch經(jīng)典信號(hào)途徑(通過(guò) RBP－J或MAML)并不參與Delta在Th 1細(xì)胞分化的調(diào)控過(guò)程［48］。

4.3 Notch信號(hào)與Th 2的關(guān)系

APCs表達(dá)Jagged配體誘導(dǎo)體外Th向Th 2細(xì)胞分化［43］;但Jagged2配體不足以誘導(dǎo)體內(nèi)Th向Th 2細(xì)胞分化［48］;甚至有研究表明Jagged 2不是體內(nèi)Th 2細(xì)胞分化的必需條件［49］。在氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness)模型中，DCs表面Jagged1配體通過(guò)誘導(dǎo)IL－4參與調(diào)控Th細(xì)胞的起始分化過(guò)程［50］。上述研究結(jié)果提示Jagged 1配體參與Th 2細(xì)胞免疫反應(yīng)。

經(jīng)Toll受體(toll－like receptors，TLR)刺激后的DC細(xì)胞表達(dá)Delta 1和Delta 4配體，抑制輔助性T細(xì)胞向Th 2發(fā)育。Gata 3是Notch信號(hào)抑制Th 1細(xì)胞發(fā)育，誘導(dǎo)Th 2細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵因子［51］，當(dāng)阻斷IL－4對(duì)Gata 3的誘導(dǎo)作用時(shí)，在降低DCs細(xì)胞表面Delta配體表達(dá)量的情況下，Th 2細(xì)胞發(fā)育過(guò)程仍然被抑制［52］。抑制EAE實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的Dll配體后，能增強(qiáng)髓磷脂－特異性(myelin－specific)Th 2/Treg免疫反應(yīng)，同時(shí)抑制Th 1/Th 17細(xì)胞活性［46］。敲除Notch信號(hào)通路的其他組分(如MAML或RBP－J)能抑制小鼠體內(nèi)Th 2細(xì)胞免疫反應(yīng)［50，53］。

5 Notch信號(hào)在牙周炎發(fā)生中的可能作用機(jī)制

牙周炎(periodontitis)是由牙菌斑生物膜的細(xì)菌及其產(chǎn)物引起的結(jié)締組織附著喪失和牙槽骨破壞的一類疾病。細(xì)菌感染宿主激發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的間接免疫反應(yīng)是牙周病進(jìn)程的主要環(huán)節(jié)［54］。Th 17細(xì)胞產(chǎn)生IL－17是引發(fā)牙周病發(fā)生的主要致病因子［55］，通過(guò)牙周基礎(chǔ)治療，IL－17和IFN－γ水平降低，而IL－4水平升高，牙周局部組織炎癥明顯減輕，提示在牙周病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中，Th 2主要起保護(hù)作用，而Th 17細(xì)胞通過(guò)破壞牙周組織局部免疫機(jī)制起損害作用。

多種因子參與調(diào)控Th 17細(xì)胞分化［55－58］。在小鼠和人類Th 17分化過(guò)程中，Notch 1信號(hào)被活化［59］，阻斷Notch信號(hào)能明顯降低Th 17相關(guān)炎性因子水平，提示Notch信號(hào)在Th17分化中起關(guān)鍵作用。利用染色質(zhì)免疫沉淀方法研究發(fā)現(xiàn)，Th 17細(xì)胞中的IL－17和維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(retinoic acid－related orphan receptor γt，RORγt)受到Notch信號(hào)的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控;阻斷Notch信號(hào)能降低IL－17表達(dá)量，延緩EAE動(dòng)物體內(nèi)Th17激發(fā)的免疫疾病的進(jìn)程。進(jìn)一步表明Notch信號(hào)在Th 17細(xì)胞分化中的重要作用。

另一方面，牙周膜細(xì)胞表達(dá)Notch信號(hào)配體Jagged 1，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲狀旁腺素相關(guān)肽(parathyroid hormone－related peptide，PTHrP)能刺激牙周膜細(xì)胞高表達(dá)Jagged 1，從而參與調(diào)控RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成分化過(guò)程［60］;而骨形成因子能提高牙周膜細(xì)胞Notch信號(hào)配體Dll 1的表達(dá)水平［61］。Jagged 1通過(guò)與Notch 1受體結(jié)合抑制破骨細(xì)胞分化;而Dll 1通過(guò)與Notch 2受體結(jié)合促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，并且在破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，相對(duì)于Jagged/Notch 1的負(fù)向調(diào)控作用，Dll 1/Notch 2間的正向調(diào)控效應(yīng)為主導(dǎo)作用［62］。上述研究結(jié)果提示Notch信號(hào)可能成為治療牙周炎的新靶點(diǎn)。

6 小結(jié)

盡管Notch信號(hào)非Th1細(xì)胞分化的必須通路，但Notch信號(hào)對(duì)Th 2、Th 17、MZB細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化起到重要的正向調(diào)控作用。在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，Th 1和Th 2細(xì)胞為負(fù)向調(diào)控因子，而Th 17為正向調(diào)控因子。抑制Notch信號(hào)通路不但可直接抑制破骨細(xì)胞分化，并且可通過(guò)抑制Th 17細(xì)胞發(fā)育間接抑制破骨細(xì)胞分化。因此，Notch信號(hào)通路有望成為臨床治療牙周炎新的靶點(diǎn)。

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