高麗娜 綜述;陳發(fā)明，金 巖 審校

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安710032)

牙周炎是引起成年人牙齒喪失的主要原因之一，也是危害人類口腔和全身健康的主要口腔疾病，因此牙周炎的預(yù)防和治療越來越引起學(xué)者們的重視。目前牙周炎臨床治療方法主要包括齦上潔治、齦下刮治、根面平整、牙周手術(shù)等，其目的是去除感染、阻止病變進(jìn)程，但難以使已喪失的牙周組織獲得良好再生，臨床修復(fù)往往以長結(jié)合方式，即牙齦上皮組織沿牙根面生長，這種修復(fù)雖恢復(fù)了組織的連續(xù)性，但并未真正恢復(fù)牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能。牙周組織再生的最終目的是實現(xiàn)牙槽骨、牙骨質(zhì)以及錨定在二者之間的牙周膜的再生與功能重建。本文就近年來牙周組織再生技術(shù)的進(jìn)展作一綜述。

1 傳統(tǒng)的牙周組織再生

為了克服長結(jié)合上皮的發(fā)生和修復(fù)缺損的牙槽骨，再生醫(yī)學(xué)技術(shù)中骨移植術(shù)、引導(dǎo)組織再生術(shù)以及兩者的結(jié)合為牙周組織的再生帶來了希望。目前已廣泛的應(yīng)用于臨床牙周手術(shù)中。植骨術(shù)是指用骨和骨替代品植入牙周骨缺損部位，通過促進(jìn)新骨的形成來修復(fù)骨缺損，恢復(fù)牙槽骨的解剖形態(tài)，以達(dá)到牙周組織再生和新附著形成的手術(shù)方法。該技術(shù)主要是利用植骨材料的骨發(fā)生、骨誘導(dǎo)、骨引導(dǎo)性發(fā)揮作用［1－2］。引導(dǎo)組織再生術(shù)是在牙周手術(shù)中利用膜性材料的物理屏障作用，阻止生長較快的結(jié)締組織、牙齦上皮細(xì)胞進(jìn)入缺損區(qū)并保持一定的組織生存空間，引導(dǎo)牙周膜細(xì)胞優(yōu)先占領(lǐng)根面，從而為牙周組織的修復(fù)再生提供時間和空間［3－4］。繼引導(dǎo)組織再生術(shù)后，生長因子，釉基質(zhì)衍生物的使用雖一定程度上加速了牙周組織再生的進(jìn)程［5－6］，但多年的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)這些技術(shù)的再生能力有限，再生組織僅僅局限在牙周缺損的底部，并且在很大程度上受缺損形式和剩余組織量的影響。

2 干細(xì)胞介導(dǎo)的組織再生

干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)是近年來方興未艾的生物醫(yī)學(xué)新領(lǐng)域，其旨在通過干細(xì)胞移植、分化和組織再生，促進(jìn)機體創(chuàng)傷修復(fù)、治療疾病。干細(xì)胞移植是否有效，能否實現(xiàn)向臨床轉(zhuǎn)化取決于移植細(xì)胞的來源和功能、移植到體內(nèi)的細(xì)胞能否準(zhǔn)確定位、移植細(xì)胞的存活數(shù)量以及與周圍組織的整合程度。不同移植方式移植的細(xì)胞其體內(nèi)發(fā)揮效果也不同。目前細(xì)胞移植方式主要有支架承載型和無支架型。其中支架承載型多見于組織工程，無支架型主要包括單細(xì)胞懸液注射，以及近些年來發(fā)展的細(xì)胞膜片技術(shù)。

2.1 單細(xì)胞懸液注射

傳統(tǒng)的干細(xì)胞移植主要通過注射骨髓細(xì)胞來治療一些致死性［7－10］或非致死性疾病如嚴(yán)重肝衰竭［11］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?2］、周圍缺血性疾病等。最近臨床上通過將骨髓細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞直接注射到缺血心肌來進(jìn)行組織特異性功能修復(fù)，避免了整個器官的移植［13－14］。這種將單細(xì)胞懸液直接或間接注射到組織病損區(qū)的方法具有操作簡便、創(chuàng)傷小、適合治療各種疾病。但由于細(xì)胞懸液的流動性、注射后細(xì)胞容易丟失、不能準(zhǔn)確定位、不利于細(xì)胞與病損部位結(jié)合，導(dǎo)致發(fā)揮作用的細(xì)胞量很少;另外，細(xì)胞注射液不能提供一定的機械支持力、容易遷移進(jìn)入毛細(xì)血管從而可能導(dǎo)致毛細(xì)血管栓塞，影響局部血供。最重要的是:這種方法促進(jìn)牙周組織再生的能力有限，不能達(dá)到牙周組織的完全再生。Mcgire等［15］將自體牙齦成纖維細(xì)胞多次注射到預(yù)處理的牙齦乳頭處，以期恢復(fù)其高度，他們發(fā)現(xiàn)這種方法雖然安全，但只在組織愈合的前2個月有較明顯效果，且不能完全恢復(fù)至初始高度。

2.2 牙周組織工程技術(shù)

牙周組織工程主要包括三個因素:種子細(xì)胞、生長因子和生物支架。通過將體外培養(yǎng)的高濃度、功能相關(guān)的活細(xì)胞種植于具有良好生物相容性和生物降解性的細(xì)胞外基質(zhì)材料上，在生長因子的作用下，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，再將這種細(xì)胞和生物材料復(fù)合體植入牙周病損部位，以形成新的具有其原來特殊功能和形態(tài)的相應(yīng)牙周組織，達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的［16－17］。魯紅等［18］報道:體外培養(yǎng)的動物自體牙周膜細(xì)胞(PDLCs)能在納米羥基磷灰石(nHAC)材料三維支架上牢固貼附并生長旺盛，將PDLCs－nHAC植入動物體內(nèi)，與對照組相比有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨質(zhì)生成，缺損處牙周組織幾乎完全再生 ，且未見上皮長入。由此可見:牙周組織工程在很大程度上促進(jìn)了組織再生量，但也存在一些不足之處，如:①種子細(xì)胞來源和體內(nèi)分化問題，這些研究大多數(shù)是三維基質(zhì)上接種單一類型細(xì)胞后移植到組織缺損處，還沒有一個研究得到期望的組織重建，可能是由于細(xì)胞來源的選擇困難以及很難控制細(xì)胞在局部的分化;②生長因子的作用機制不完全了解以及緩、控釋問題;③支架材料可能引起的局部炎癥反應(yīng)影響再生微環(huán)境等問題。

真正的牙周組織再生是結(jié)構(gòu)和功能完整的再生，兩種硬組織(牙骨質(zhì)、牙槽骨)和軟組織(牙周膜)的再生是通過前體細(xì)胞和生長因子相互作用而發(fā)生的并有一定的時間差。因此要求移植細(xì)胞和生長因子在牙周組織再生中必須精確。換句話說，并不是僅僅通過移植單一類型的細(xì)胞到缺損處進(jìn)行空間維護(hù)和在生物體內(nèi)進(jìn)行組織分化，而需要通過細(xì)胞外基質(zhì)中各種生長因子與細(xì)胞相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為，使細(xì)胞到達(dá)相應(yīng)位點發(fā)揮相應(yīng)功能來促進(jìn)組織再生。

2.3 細(xì)胞膜片技術(shù)

細(xì)胞膜片技術(shù)(cell sheet engineering)是近年來發(fā)展較快的一項組織工程學(xué)技術(shù)，它是采用非酶解的方式獲取種子細(xì)胞，以膜片中細(xì)胞自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)作為載體，從而使細(xì)胞之間的連接蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)能夠被完整地保存，避免了使用酶消化法對細(xì)胞的生物學(xué)功能如離子通道、細(xì)胞因子感受器和細(xì)胞因子受體等造成損傷。同時細(xì)胞膜片上保留的粘附蛋白能更好地促進(jìn)細(xì)胞粘附到組織上而不需要縫合。除此之外，細(xì)胞膜片還具有可塑性，不受缺損形態(tài)的影響;而且不需要支架材料，避免了支架材料降解成分對組織細(xì)胞的危害。目前該技術(shù)已大量應(yīng)用于皮膚、角膜、心臟和骨組織等再生醫(yī)學(xué)的研究，其中角膜緣上皮細(xì)胞和自體口腔黏膜細(xì)胞膜片已成功應(yīng)用于臨床［19］。

2.3.1 細(xì)胞膜片的制備方法

牙周膜細(xì)胞膜片技術(shù)的制備方法有酶溶解法、外科切取法和溫度敏感式培養(yǎng)法。Nagai N［20］(2004)將牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)于鮭魚不全膠原上，采用膠原酶溶解法獲取了結(jié)構(gòu)較為完整的牙周膜細(xì)胞膜片。該方法對細(xì)胞的活性不存在負(fù)面影響，便于完整獲取大面積的單層細(xì)胞膜片。但是酶可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維結(jié)合素和整合素，可降低膜片的粘附力或致膜片的收縮。有報道稱:維生素C可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌［21］，通過含有維生素C的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)數(shù)周而獲得的細(xì)胞膜片，由于其具有一定的韌性，可以用細(xì)胞刮將其機械刮下。這樣不但不會破壞細(xì)胞之間的ECM和相關(guān)蛋白，同時可以避免由于胰酶消化而導(dǎo)致的細(xì)胞活性的丟失，但對于較大面積膜片的操作較為困難。溫度敏感式培養(yǎng)［22］法是利用聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)具有溫度響應(yīng)(即以32℃為界，在疏水性－親水性間可逆變化)的特性，將PNIPAAm以共價鍵形式固定在TCPs表面進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，然后通過其溫度響應(yīng)性，使整體細(xì)胞群在保持細(xì)胞間連接狀態(tài)下以片狀形態(tài)得以脫附。與傳統(tǒng)酶解方法相比，溫度敏感式培養(yǎng)法獲得的細(xì)胞膜片可以最大限度地維持細(xì)胞間的正常連接，保持細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，而且還具有完整的對胰酶－EDTA敏感的整合素。

外科剝離和溫度感應(yīng)式培養(yǎng)技術(shù)是目前較為常用的膜片制備技術(shù)，它可以最大限度地保存膜片內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)和各種信號因子，并保存細(xì)胞－細(xì)胞外基質(zhì)間的三維連接。

2.3.2 細(xì)胞膜片技術(shù)在牙周組織再生中的應(yīng)用研究

目前細(xì)胞膜片技術(shù)已經(jīng)成為公認(rèn)的方式應(yīng)用于角膜上皮、食管上皮、氣管上皮、肝、皮膚、心肌組織等組織的再生，最近細(xì)胞膜片工程又作為新手段開始應(yīng)用于牙周組織再生。Hasegawa等［23］用含維生素C的基礎(chǔ)培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)人PDLCs 3周后形成細(xì)胞膜片，移植到免疫缺陷大鼠牙槽骨開裂模型的牙周組織缺損處，結(jié)果發(fā)現(xiàn):實驗組在牙周組織缺損區(qū)域形成類似正常牙周膜的結(jié)構(gòu)，包括有膠原纖維插入的無細(xì)胞牙骨質(zhì);而空白對照組則無類似的結(jié)構(gòu)形成，新生骨直接與根面接觸發(fā)生牙本質(zhì)－骨粘連或出現(xiàn)根面吸收。該實驗提示:牙周膜細(xì)胞膜片具有再生牙周組織的能力。

牙周組織是由軟、硬組織共同組成的一個結(jié)構(gòu)復(fù)雜的功能系統(tǒng)，采用組織工程進(jìn)行牙周組織重建時，移植的細(xì)胞必須同時具備修復(fù)結(jié)締組織和礦化組織的能力。為了提高PDLCs膜片的礦化潛能，F(xiàn)lores等［24］(2008)用含有成骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成PDLSCs膜片，將其與牙本質(zhì)塊復(fù)合移植到免疫缺陷鼠背部皮下，形成了不成熟的牙骨質(zhì)和牙周膜結(jié)構(gòu);而僅通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的PDLSCs膜片(對照組)卻沒有觀察到類似結(jié)構(gòu)。隨后Flores［25］又將經(jīng)不同誘導(dǎo)培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞膜片應(yīng)用于無胸腺大鼠牙周穿通性缺損的修復(fù)，結(jié)果顯示礦化誘導(dǎo)組大多數(shù)樣本觀察到新生牙骨質(zhì)層和膠原纖維的附著;而對照組雖有密集的細(xì)胞外基質(zhì)和纖維形成，但牙骨質(zhì)再生率顯著低于實驗組。

與其他細(xì)胞移植方式相比，細(xì)胞膜片技術(shù)雖可避免酶消化過程對各種膜相關(guān)蛋白的水解，但細(xì)胞膜片的強度還不足以實際應(yīng)用。為加強牙周膜細(xì)胞膜片的強度，Akizuki等［26］將Beagle犬的自體牙周膜細(xì)胞在含有維生素C的基礎(chǔ)培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)2周獲得牙周膜細(xì)胞層片，再用強化透明質(zhì)酸膜作為載體回植到Beagle犬下頜雙側(cè)第一磨牙近中牙根頰面牙周缺損區(qū)，術(shù)后8周，實驗組3個術(shù)區(qū)觀察到有骨組織、牙周韌帶和牙骨質(zhì)形成，顯著高于僅用強化透明質(zhì)酸膜的對照組。Iwata［27］(2009)通過自體移植的方式在三壁骨缺損的牙根表面植入聚乙醇酸(PGA)支撐的三層牙周膜干細(xì)胞膜片，并用多孔β－磷酸三鈣充填骨缺損區(qū)，結(jié)果顯示:細(xì)胞膜片移植組再生出了新骨、牙骨質(zhì)以及連接二者排列整齊的膠原纖維，而沒有進(jìn)行細(xì)胞膜片移植的對照組只觀察到有限的骨再生。

對于復(fù)雜組織再生，關(guān)鍵是創(chuàng)造一個近似天然的微環(huán)境，以控制細(xì)胞的增殖、遷移和分化。楊振華［28］(2009)模擬牙根－牙周發(fā)育的微環(huán)境，利用根端牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)液APTG－CM成功誘導(dǎo)形成PDLSCs細(xì)胞膜片，并利用膜片體外容易聚合成團(tuán)的特性建立高密度細(xì)胞聚合體的三維立體培養(yǎng)體系;最后對具備一定強度和厚度的不同類型細(xì)胞聚合體進(jìn)行體外修整、塑形和疊加后分別復(fù)合到陶瓷牛骨(CBB)和牙本質(zhì)片上移植到裸鼠皮下，結(jié)果顯示:移植6周形成了類牙周膜樣結(jié)構(gòu)。牙囊是在牙周組織發(fā)育早期通過上皮細(xì)胞層從正在發(fā)育的牙本質(zhì)中分離出來的，在牙發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。近年來，大量的體內(nèi)、體外研究證實:牙囊來源的細(xì)胞具有分化為牙周組織形成細(xì)胞(牙周成纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞)的能力［29］。Handa等［30］將分離培養(yǎng)的牛牙囊細(xì)胞與羥基磷灰石復(fù)合，植入裸鼠體內(nèi)，4周即發(fā)現(xiàn)在羥基磷灰石表面有牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成。Bai Yudi等［31］用上皮根鞘細(xì)胞(HERS)與牙囊細(xì)胞(DFC)共同培養(yǎng)1周后，I型膠原(col－1)、ALP、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2)、骨涎蛋白(BSP)等在mRNA水平均明顯提高;培養(yǎng)3周后，ALP、OCN、BSP、OPG表達(dá)陽性的DFCs細(xì)胞數(shù)量增多，DFCs也產(chǎn)生了更多的鈣化結(jié)節(jié)。作者又將HERS誘導(dǎo)3周后的DFC形成細(xì)胞膜片并移植到雄性大鼠網(wǎng)膜下，5周后發(fā)現(xiàn)有牙骨質(zhì)樣組織和牙周韌帶樣組織形成;而未經(jīng)HERS誘導(dǎo)的DFC膜片(對照組)僅產(chǎn)生了纖維組織。該實驗表明:經(jīng)HERS誘導(dǎo)后DFC細(xì)胞膜片可通過上皮－間充質(zhì)相互作用而產(chǎn)生牙周組織。

目前通過細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建組織主要有三種方式:一是單層細(xì)胞膜片直接移植到宿主體內(nèi)，如皮膚［32］、角膜上皮［33］、膀胱尿路上皮［34］、牙周韌帶組織［35］等;二是應(yīng)用同型細(xì)胞膜片多層復(fù)合來重建組織三維結(jié)構(gòu)，如心肌組織［36］、平滑肌組織［37－38］;三是通過不同類型細(xì)胞膜片的多層復(fù)合來構(gòu)建更加復(fù)雜的層狀組織結(jié)構(gòu)，如肝小葉［16］、腎小球。對于牙周組織，目前已證明基于單細(xì)胞類型的再生能力有限，多種細(xì)胞復(fù)合的細(xì)胞膜片可獲得滿意的結(jié)果。謝函等［39］將利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)獲得的人髂骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)和人牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)的混合膜片形成細(xì)胞團(tuán)塊后與煅燒陶瓷牛骨復(fù)合移植到裸鼠皮下，結(jié)果顯示:再生出了帶有血管化的牙骨質(zhì)－牙周膜樣組織。該結(jié)果提示，混合的細(xì)胞膜片(團(tuán)塊)能模擬牙周再生的微環(huán)境，從而達(dá)到生理學(xué)意義上的牙骨質(zhì)－牙周膜樣組織的再生。

3 牙周組織再生的發(fā)展和展望

3.1 干細(xì)胞的異體應(yīng)用

牙周膜干細(xì)胞被認(rèn)為是牙周組織再生的最佳種子細(xì)胞來源，但牙周病的病人大多數(shù)是中老年人，牙周膜干細(xì)胞十分有限，且細(xì)胞體外培養(yǎng)時間很長，極大影響了牙周再生技術(shù)的開展。如果干細(xì)胞能異體應(yīng)用，通過建立細(xì)胞庫就可以擴大牙周再生種子細(xì)胞的來源，極大推進(jìn)牙周組織再生的發(fā)展，加快牙周組織再生技術(shù)向臨床的轉(zhuǎn)化。要解決牙周膜干細(xì)胞的異體應(yīng)用，首先要研究牙周膜干細(xì)胞的免疫學(xué)特性，最近有學(xué)者［40］建立了一個新的方式，即將同種異體牙周膜干細(xì)胞膜片用于小型豬牙周炎模型中，結(jié)果顯示，移植12周后，自體牙周膜干細(xì)胞膜片組和同種異體牙周膜干細(xì)胞膜片組均表現(xiàn)出明顯的牙周組織再生，并且同種異體細(xì)胞移植在動物體內(nèi)并沒有發(fā)生免疫反應(yīng)。該研究證明了牙周膜干細(xì)胞具有低免疫原性。

3.2 提高細(xì)胞膜片的生物學(xué)性能和可操作性

細(xì)胞膜片是由細(xì)胞與自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)組成，移植到體內(nèi)后易于適應(yīng)環(huán)境，能較長時間保持細(xì)胞活性，且細(xì)胞的生長方式類似于組織塊法，細(xì)胞沿邊緣爬出。因此將細(xì)胞膜片適時引入到牙周組織工程將是今后牙周組織再生、重建可供選擇的方案之一。但這樣的結(jié)構(gòu)也決定了細(xì)胞膜片容易攣縮的特征，尤其是具有較強收縮能力的纖維細(xì)胞膜片在無外源性載體的支持下會因細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架的收縮而出現(xiàn)攣縮，但外源性載體的應(yīng)用可能會干擾組織的代謝和改建，且過度刺激細(xì)胞外基質(zhì)的分泌而對膜片的結(jié)構(gòu)和功能造成不利的影響，因此應(yīng)當(dāng)深入探討細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的生物學(xué)機制以及優(yōu)化膜片制備的方式，充分保證有效的膜片強度并避免種子細(xì)胞的不利分化。另外，還應(yīng)綜合牙周再生的影響因素，系統(tǒng)地掌握不同的牙周缺損修復(fù)和組織再生對移植細(xì)胞的量效關(guān)系、移植時間以及移植途徑的需求，并通過建立先進(jìn)的高解析度、非侵入式成像技術(shù)實時地評估組織再生的生理和功能療效。

3.3 微環(huán)境的調(diào)控

所謂的“微環(huán)境”，就是由細(xì)胞、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)共同構(gòu)成的動態(tài)環(huán)境，它是細(xì)胞在體內(nèi)賴以生存的局部條件，控制著細(xì)胞的增殖、分化。為了能更好的保障移植細(xì)胞的量和細(xì)胞的活性，應(yīng)當(dāng)通過調(diào)控局部微環(huán)境，使移植膜片內(nèi)的細(xì)胞能在植床內(nèi)盡早而有效的附著、生長和轉(zhuǎn)化;通過物理、化學(xué)、生物刺激和調(diào)節(jié)膜片與受體組織相融合，盡早發(fā)揮功能，促進(jìn)牙周組織再生。另一方面，目前對于牙周膜干細(xì)胞膜片在牙周再生中的研究多采用急性牙周缺損模型來評價，因干擾因素較少，能夠較為充分地證實牙周膜干細(xì)胞和細(xì)胞膜片的再生機制，但急性牙周缺損模型不能代表復(fù)雜的慢性牙周炎狀況，慢性牙周炎癥對牙周組織的影響是全方面的，包括牙周膜細(xì)胞、牙周韌帶、牙根面、牙周的生物力學(xué)性能等，因此應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步探討種子細(xì)胞與牙周微環(huán)境的相互作用，有針對性地改善各種不利的微環(huán)境因素對種子細(xì)胞的影響以促進(jìn)真正意義上的功能性牙周組織重建。

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