張芳英，楊繼章，楊樹(shù)民，穆麗娟，張旭東，張征

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，石家莊 050031;2.河北省人民醫(yī)院藥劑科，石家莊 050051)

痤瘡是青少年常見(jiàn)的、多發(fā)的皮脂腺疾病，其發(fā)病與激素水平、毛囊皮脂腺導(dǎo)管角化異常和微生物感染等諸多因素有關(guān)［1］。痤瘡的常見(jiàn)致病菌是痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，而痤瘡丙酸桿菌與痤瘡的發(fā)生及炎癥反應(yīng)的加重有明確關(guān)系。減少皮膚毛囊中主要致病菌的數(shù)量是治療痤瘡的主要途徑之一。蜂膠是一種具有廣泛藥理作用的天然產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的抗微生物活性，國(guó)內(nèi)外對(duì)蜂膠的抗菌作用多有報(bào)道［2］。在臨床各領(lǐng)域均有應(yīng)用，尤其內(nèi)服、外用在皮膚病方面，包括各種皮炎、痤瘡、銀屑病、燒燙傷等均有療效［3］。為探討蜂膠提取物治療痤瘡的可行性，本課題組用不同溶劑、不同濃度的河北產(chǎn)蜂膠對(duì)痤瘡常見(jiàn)致病菌做了系列研究，筆者就河北產(chǎn)蜂膠提取物對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌作用報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥 蜂膠(河北安國(guó)養(yǎng)蜂場(chǎng)提供原蜂膠)。

1.2 儀器 DH3600AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司);96孔一次性使用培養(yǎng)板(浙江拱東醫(yī)用塑料廠);連續(xù)微量加樣器(美國(guó)Eppendorf公司);厭氧罐(河北省人民醫(yī)院提供)。

1.3 菌株及試劑 痤瘡丙酸桿菌凍干菌株(ATCC11827，購(gòu)于廣東省微生物研究所)，BD BACTECTMLytic/10 Anaerobic/F(Becton，Dickinson and Company Sparks，MD21152，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科提供)，皰肉培養(yǎng)基(河北省人民醫(yī)院提供)。95%乙醇，75%乙醇，純化水，滅菌0.9%氯化鈉溶液。

1.4 藥液的制備 稱取原蜂膠10 g，3份，冷凍24 h后粉碎成顆粒，放入無(wú)菌玻璃瓶中，分別用95%乙醇、75%乙醇、純化水各100 mL浸泡粉碎后的顆粒，放置陰涼避光處，每日振蕩3或4次，2周后取濾紙過(guò)濾，得各溶劑蜂膠提取液，其濃度為100 mg·mL－1。再分別取不同溶劑提取蜂膠液1 mL，用連續(xù)微量加樣器加入滅菌0.9%氯化鈉溶液11.207 mL，配制成最終濃度為 8192 μg·mL－1的蜂膠液備用。

1.5 菌種復(fù)蘇 在無(wú)菌條件下從保存菌種斜面上沾取一定量痤瘡丙酸桿菌，接種在皰肉培養(yǎng)基上放入?yún)捬豕拗校瘸檎婵?，再充?0%氫氣、5%二氧化碳、平衡氮?dú)饣旌蠚怏w，在無(wú)氧條件下放入電熱恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h，備用。

1.6 菌懸液制備 用無(wú)菌接種環(huán)挑取培養(yǎng)基上痤瘡丙酸桿菌，用BD培養(yǎng)液、滅菌0.9%氯化鈉溶液校正至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用BD培養(yǎng)液1∶100倍稀釋，至菌懸液濃度為 1×106cfu·mL－1。

1.7 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定

1.7.1 微量板制備及點(diǎn)種 取一次性無(wú)菌96孔U型底培養(yǎng)板一個(gè)，向每孔加入BD培養(yǎng)液100 μL，在每排的第1孔分別加入濃度為8192 μg·mL－1的蜂膠95%乙醇、75%乙醇和水提取液 100 μL，然后吸取100 μL至第2孔，混勻后再吸取100 μL至第3孔，如此連續(xù)倍比稀釋至第11孔，并從第11孔中吸取100 μL棄去，第12孔為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。再向第1～11孔每孔分別加入痤瘡丙酸桿菌菌懸液100 μL，至此，藥物最終濃度為 2048 ，1024 ，512，256，128，64，32，16，8，4 μg·mL－1。操作全過(guò)程均為無(wú)菌操作。

1.7.2 菌株的培養(yǎng) 將培養(yǎng)板放入?yún)捬豕拗?，先抽真空，再?zèng)_入10%氫氣、5%二氧化碳、平衡氮?dú)饣旌蠚怏w，放入電熱恒溫培養(yǎng)箱中在37℃條件下培養(yǎng)48 h。

1.7.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)才有意義。

2 結(jié)果

蜂膠95%乙醇提取液、蜂膠75%乙醇提取液、蜂膠水提取液對(duì)痤瘡丙酸桿菌 MIC值分別為512，8，54 μg·mL－1，可見(jiàn)對(duì)痤瘡丙酸桿菌均有抑菌作用，其中蜂膠75%乙醇提取液的MIC值最小，抑菌效果最好。

3 討論

痤瘡的治療藥物種類繁多，維A酸類和抗菌藥物是臨床上較常使用的藥物。維A酸類外用和口服均有一定的不良反應(yīng)，外用可引起皮膚刺激、紅斑及脫屑?？咕幬锒酁槊字Z環(huán)素、克林霉素、紅霉素，長(zhǎng)期及不規(guī)則用藥可引起細(xì)菌耐藥。國(guó)內(nèi)外很多文獻(xiàn)報(bào)道了蜂膠對(duì)細(xì)菌有較好的抑制作用，但筆者未見(jiàn)對(duì)痤瘡丙酸桿菌抑菌活性的研究報(bào)道。近年來(lái)，中藥提取物對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌作用亦多見(jiàn)報(bào)道，如大黃游離蒽醌、大黃、黃芩、金銀花、黃柏等14味中藥對(duì)痤瘡丙酸桿菌均有抑菌作用［4-5］。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較蜂膠醇提取物對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌作用優(yōu)于其他中藥提取物。

蜂膠的藥用價(jià)值是它作為一種天然混合物表現(xiàn)出來(lái)的，蜂膠萃取物含有200多種物質(zhì)，含有的抗菌成分主要有高良姜素、短葉松素、白楊素、喬松素、5-羥-7，4，二甲氧黃酮、雙氫黃酮、阿魏酸等，并證明了蜂膠的抗菌作用是多種成分協(xié)同的結(jié)果。蜂膠的抗菌、殺菌作用機(jī)制十分復(fù)雜，蜂膠能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生溶菌作用，并能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，其確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討。國(guó)內(nèi)外研究均表明不同提取方法、不同提取溶媒蜂膠表現(xiàn)出不同的藥理作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明不同溶劑的蜂膠提取物對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌濃度不同，均表現(xiàn)出良好的抑菌效果。

蜂膠由于地域的不同，其化學(xué)成分、抗菌作用也存在一定差異。國(guó)外對(duì)不同地域產(chǎn)蜂膠的抗菌作用的研究報(bào)道較多，國(guó)內(nèi)在這一領(lǐng)域的研究較少。曾莉萍等［6］用河南產(chǎn)蜂膠乙醇提取物對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌的抗菌作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究，得出結(jié)論為蜂膠乙醇提取物對(duì)甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、白念珠菌、金黃色葡萄球菌及其耐藥菌株、白喉?xiàng)U菌、溶壁微球菌均有抗菌作用。對(duì)厭氧菌的報(bào)道只檢索到熊萍等［7］報(bào)道了云南蜂膠75%乙醇蜂膠液對(duì)牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌(Pg)、具核梭桿菌(Fn)、放線桿菌(Aa)的抑制作用，結(jié)果蜂膠乙醇溶液對(duì)3種細(xì)菌都有抑制作用，對(duì)Pg、Fn、Aa的 MIC 分別為 6.25，12.50，25.00 μg·mL－1。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明河北產(chǎn)蜂膠提取物對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌作用較好。

研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠中大量有效成分可以凈化血液，營(yíng)養(yǎng)肌膚，抑制過(guò)氧化脂質(zhì)生成，抑制酪氨酸酶活性，又可以吸收紫外線，從而保護(hù)肌膚，祛斑，增白［8］。張?zhí)鞂毜龋?］用蜂膠乙醇提取物對(duì)家兔進(jìn)行皮膚急性毒性實(shí)驗(yàn)、皮膚刺激實(shí)驗(yàn)及豚鼠過(guò)敏實(shí)驗(yàn)，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)和死亡，也未見(jiàn)皮膚充血、紅腫等不良反應(yīng)，對(duì)豚鼠重復(fù)接觸，也未見(jiàn)皮膚出現(xiàn)抗體免疫反應(yīng)。鑒于蜂膠的上述優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合本課題前期研究結(jié)果——河北產(chǎn)蜂膠醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌具有良好的抗菌作用，得出河北產(chǎn)蜂膠醇提取物對(duì)痤瘡常見(jiàn)致病菌具有良好的抗菌作用，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)蜂膠制劑治療痤瘡提供了科學(xué)的依據(jù)。

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