李 凡，張 浩，李庭玉，馬書玲

顱腦損傷(外傷、交通事故)在法醫(yī)學實踐中非常多見，顱腦損傷標志著案件的發(fā)生；準確推斷腦損傷時間，直接關系到案件的偵破；在臨床實踐中腦損傷后神經細胞壞死、凋亡直接關系到傷者的神經功能喪失和傷殘程度。以往有關腦損傷神經細胞凋亡的研究主要關注腦缺血、缺氧性損傷和神經細胞病變，如老年癡呆癥、帕金森癥和癲癇等[1-2]。對創(chuàng)傷性腦損傷的神經細胞凋亡動物試驗研究很有限，對人腦損傷的研究報道更少[3]。本文對不同損傷時間的人腦挫傷組織進行TUNEL染色和Caspase-3免疫組化染色，探討腦挫傷后神經細胞凋亡和調控因子Caspase-3表達的時間和空間變化，有望探索推斷腦損傷時間的新方法。

1 材料與方法

1.1材料36例人腦挫傷組織蠟塊選自死于顱腦損傷的檢驗案例，死者性別不限，年齡18～60歲，既往健康，死亡原因為嚴重顱腦損傷，大體檢驗腦挫傷明顯。腦組織蠟塊均經常規(guī)HE方法處理制備。根據損傷時間不同分為6個實驗組，即2 h以內組、4～6 h組、11～13 h組、23～25 h組、48 h及以上組，每組6例；對照組6例，為同年齡組，既往健康，因機械性損傷致心臟或大血管破裂引起急性失血短時間(1 h)內死亡者腦組織標本。所有腦組織標本均在死后2～56 h通過尸體解剖取材。主要試劑：TUNEL染色試劑(美國ROCH公司產品)；Caspase-3 免疫組化試劑(一抗、二抗等)由武漢博士德公司提供(BA0588，SA1022)。主要儀器：奧林匹斯顯微鏡和Image-Pro Plus 專業(yè)圖像分析系統。

1.2方法

1.2.1 常規(guī)HE染色 所有腦挫傷組織標本(約1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm)，用中性10%福爾馬林固定24～48 h，梯度酒精脫水，二甲苯置換，石蠟包埋，連續(xù)切片(5 μm)，常規(guī)HE染色、封片。

1.2.2 TUNEL染色 TUNEL染色根據文獻報道的方法略加改進[4]。石蠟切片經脫蠟、水化置換入雙蒸水中；用蛋白酶K(20 μg/mL)消化，37 ℃ 孵育30 min，PBS洗2次；滴加50 μL的TUNEL反應混合液(1份TdT酶—末端脫氧核糖核酸轉移酶，9份dUTP標記溶液)，在濕盒內37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次；擦干樣品周圍的水分，滴加50 μL用PBS 1∶100 稀釋的轉化劑POD，放入濕盒37 ℃ 孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加50～100 μL DAB溶液顯色，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，蘇木素復染5 min。切片經脫水、透明、封片。TUNEL染色的陰性對照以pH7.4，0.01 M/L PBS代替TUNEL反應混合液。在相同試驗條件下、同批次染色挫傷組(不同損傷時間)和對照組腦組織切片。

1.2.3 免疫組化染色 按照試劑盒中說明書操作方法進行，厚度為5 μm 的石蠟切片經脫水置換入雙蒸水；用3% H2O2室溫、10 min，消除內源性過氧化物酶，雙蒸水洗3次；在枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)中，微波(700 W)80～90 ℃抗原修復4 min，PBS洗2次；滴加可溶性人血清白蛋白封閉非特異性抗原，室溫15 min，甩去人血清白蛋白，滴加50 μL一抗(1∶50稀釋)，在濕盒內37 ℃ 孵育60 min，4 ℃過夜，PBS(pH 7.2～7.6)沖洗3次；滴加50 μL 二抗，放入濕盒37 ℃ 孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加SABC試劑，同樣37 ℃ 孵育30 min，PBS沖洗3次；DAB顯色5～10 min(顯微鏡下控制染色進程)，蘇木素復染5 min，切片經脫水、透明、封片。在相同試驗條件下、同批次染色挫傷組(不同損傷時間)和對照組腦組織切片。Caspase-3一抗稀釋度為1∶50，Caspase-3免疫組化陰性對照以PBS代替一抗。

2 結果

2.1 HE染色腦挫傷組織可見有：出血，神經細胞腫脹、壞死，尼氏小體消失，細胞核溶解，周圍腦組織水腫明顯，局灶性蛛網膜下腔出血；隨著損傷時間的延長，腦組織內神經細胞壞死明顯，小膠質細胞和少突膠質細胞增多，蛛網膜下腔可見中性粒細胞浸潤。

2.2 TUNEL染色TUNEL陽性細胞核呈棕黃色—黃色，陰性細胞核為藍色。陽性細胞核主要分布于挫傷灶的中央區(qū)和周圍的半影區(qū)，兩者有顯著差異，P<0.05，半影區(qū)比中央區(qū)更顯著；遠隔部位和對照組呈陰性。并且，挫傷半影區(qū)陽性細胞數目和染色深度隨損傷時間延長，逐漸增加。統計分析發(fā)現，挫傷半影區(qū)陽性率和陽性細胞IOD與損傷時間之間呈線性關系，r分別為0.89和0.93(見表1和圖1)。中央區(qū)不同損傷時間組之間差異沒有統計學意義，P>0.05。

表1 不同損傷時間腦挫傷組織TUNEL染色陽性率和

① 組間比較P<0.05, ② 半影區(qū)與中央區(qū)相比P<0.05

表2 不同損傷時間腦挫傷組織Caspase-3染色的陽性率和

① 組間比較P<0.05,② 半影區(qū)與中央區(qū)相比P<0.05

圖1 不同損傷時間人腦挫傷半影區(qū)TUNEL染色結果(TUNEL×400)

圖2 不同損傷時間人腦挫傷半影區(qū)Caspase-3免疫組化染色結果(免疫組化×400)

2.3 Caspase-3免疫組化染色陽性染色呈棕黃色，位于神經細胞漿內，陰性細胞為藍色。Caspase-3染色陽性部位和TUNEL染色陽性細胞分布相似，主要分布在挫傷灶中央及其周圍的半影區(qū)，兩者有顯著差異，P<0.05，半影區(qū)比中央區(qū)更顯著；其他部位呈陰性；表達的時序性改變與TUNEL染色基本平行。半影區(qū)陽性率和陽性細胞的IOD均與損傷時間之間呈線性關系，r分別為0.92和0.90(見表2和圖2)。中央區(qū)不同損傷時間組之間差異沒有統計學意義，P>0.05。

3 討論

腦損傷時間推斷是法醫(yī)病理學領域里的研究熱點，許多學者試圖通過檢測顱腦損傷后病理生理過程中出現的某些細胞和細胞因子等指標，研究其在腦損傷后的表達變化，探索腦損傷時間推斷的新方法。顱腦損傷后神經細胞凋亡是由許多調控基因和調節(jié)因子表達水平不斷變化，引發(fā)的一系列級聯反應的結果，在這一過程中存在時間—空間的規(guī)律性變化[5-6]。在法醫(yī)學領域里對顱腦損傷后神經細胞凋亡及其調節(jié)因子表達變化的觀察進行損傷時間推斷的研究，國內僅有少量動物實驗報道，尚無對人腦挫傷組織的研究報道；國外僅有少數幾位學者的研究報道。Hausmann 等在證實大鼠腦損傷后神經細胞凋亡的實驗研究基礎上，提出人腦損傷后神經細胞凋亡數目的時序性變化，可以用于法醫(yī)學損傷時間推斷的設想[7]。Drebler 等觀察到腦損傷時間與神經細胞及膠質細胞凋亡之間有相關性，認為神經細胞和膠質細胞的凋亡情況可以用于腦損傷早期推斷損傷時間[8]。本研究發(fā)現，人腦挫傷半影區(qū)陽性細胞數目和染色深度隨損傷時間延長，逐漸增加；TUNEL染色陽性率和IOD均與損傷時間之間有較好的線性關系，可以用于腦挫傷損傷時間推斷。與Hausmann 和Drebler 等學者的觀點一致。Caspase-3是天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶Caspases超家族成員中較活躍的成員之一，參與細胞凋亡信號傳導的級聯反應，與細胞凋亡關系密切[9]。本研究表明，Casepase-3染色陽性部位和TUNEL染色陽性細胞相似，分布在腦挫傷灶的中央區(qū)及其周圍的半影區(qū)，遠隔部位和對照組呈陰性。表達的時序性變化與TUNEL染色基本平行。半影區(qū)的陽性細胞率和IOD有緩慢上升趨勢。

腦損傷后神經細胞凋亡已在多種創(chuàng)傷性腦損傷動物模型中得到證實，HE染色難以反映，TUNEL染色和Caspase-3免疫組化則容易區(qū)分[10]。在法醫(yī)損傷學方面，神經細胞凋亡被認為是腦損傷后引起繼發(fā)性損害的主要原因，特別是遲發(fā)性神經元的壞死機制與神經細胞凋亡密切相關；神經細胞凋亡發(fā)生的部位比壞死出現的部位范圍更廣。本研究也觀察到，人腦挫傷后2 h就會發(fā)生神經細胞凋亡；凋亡細胞主要分布在腦挫傷灶的中央區(qū)及其周圍的半影區(qū)，半影區(qū)比中央區(qū)更顯著，P<0.05；與遠隔部位和對照組的陰性染色形成鮮明對比。與文獻報道的人腦外傷后存在神經細胞凋亡，且與患者的病情嚴重程度、病程和愈后相關的結果一致[11]。因此，通過對神經細胞凋亡以及調控因子變化的觀察，有助于鑒別生前、死后損傷和判斷腦挫傷部位，為顱腦損傷的法醫(yī)學鑒定和研究帶來新的課題。

對比TUNEL染色和Caspase-3免疫組化染色的結果發(fā)現，兩種染色方法的陽性率和陽性細胞IOD與腦損傷時間之間的線性關系基本相同。而且，檢測半影區(qū)的陽性細胞率和IOD 2個參數，采用多元回歸的方法分析，更有利于提高腦損傷時間推斷的準確性。本研究中使用的人腦挫傷組織均來源于實際檢案的案例尸檢標本，而且TUNEL染色和Caspase-3免疫組化染色結合圖像分析技術，結果客觀、可靠，能夠直接應用到法醫(yī)學實踐中。但TUNEL染色操作技術難度高、試劑昂貴，影響該技術的普及和應用。而Caspase-3免疫組化染色技術可以廣泛應用于法醫(yī)病理學檢驗實踐[12]。

(致謝：感謝四川大學華西基礎醫(yī)學和法醫(yī)學院法醫(yī)病理教研室老師們對本課題研究的指導和支持，在此深表感謝！)

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