費宇杰 左后娟 秦 瑾 曾和松 劉正湘

整合素α3、α6在CD151促進Hep G2細胞增殖、侵襲中的作用

費宇杰 左后娟 秦 瑾 曾和松＊劉正湘＊

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院心內(nèi)科，武漢430030）

目的 觀察CD151轉(zhuǎn)染Hep G2細胞后對細胞增殖，侵襲的影響及其與整合素的關(guān)系。方法 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，將質(zhì)粒CD151及其突變體CD151-AAA轉(zhuǎn)染Hep G2細胞，觀察轉(zhuǎn)染后細胞增殖，侵襲的變化；免疫共沉淀法檢測整合素的表達情況。結(jié)果 CD151-AAA突變體較CD151促細胞增殖力低，其侵襲力未見增強，且其免疫共沉淀未能檢測到整合素的表達。結(jié)論 CD151促進Hep G2細胞增殖，侵襲有賴于CD151-整合素α3／α6復(fù)合體的形成。

細胞增殖；Transwell；CD151；CD151-AAA

腫瘤的治療是一個世界性的難題，攻克癌癥術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是當(dāng)今醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)的重點與難點。四跨膜蛋白超家族中，CD151是其中重要的分子，其高表達于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌和橫紋肌細胞、血小板［1］。其參與了多種生物過程，包括細胞粘附、增殖、分化，信號傳導(dǎo)，病理性血管的生成和轉(zhuǎn)移等［2］。研究顯示，CD151與多種腫瘤相關(guān)，其高表達多顯示腫瘤病人預(yù)后不良。本實驗主要研究CD151在體外對Hep G2細胞增殖，侵襲力的影響，及其與整合素α3、α6的關(guān)系，探討CD151體外對腫瘤細胞生長的作用及其與整合素的相關(guān)性。

材料和方法

1.材料

p AAV-CD151質(zhì)粒，CD151單克隆抗體5C11由美國田納西大學(xué)健康科學(xué)中心血管生物中心和醫(yī)學(xué)系張欣教授饋贈。Wester n bl ot化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)和辣根過氧化物酶偶聯(lián)兔抗鼠Ig G購自PIERCE公司。PVDF膜購自Roche公司?？功?和α6抗體購自santa cruz公司。免疫共沉淀試劑Protein A／G-Agarose購于ab mart公司，細胞轉(zhuǎn)染試劑Attractene Transf ection Reagent購 自 QIAGEN 公司。matrigel膠購自BD公司。CCK-8試劑盒購于碧云天公司。Trans well板，孔徑8μm，購于Corning公司。

2.方法

2.1 CCK-8試劑盒檢測p AAV-CD151及突變體p AAV-CD151-AAA轉(zhuǎn)染Hep G2后對細胞增殖的影響

用高糖DMEM（GBICO）培養(yǎng)Hep G2細胞。將細胞接種于滅菌六孔板中，待細胞融合度達到40%-80% 用 Attractene Transfection Reagent（QIAGEN）轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后的細胞置于37℃，5%細胞培養(yǎng)箱中孵育2-3h。用滅菌PBS洗3-4次，加入含有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24-48 h觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48h后，將細胞消化重懸于96孔板中，每組重復(fù)3次，置于37℃細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。細胞貼壁后，每孔加入CCK-8試劑10μl，37℃孵育1 h。酶標儀450n m波長處讀數(shù)。

2.2 用Transwell板，孔徑8μm，進行腫瘤細胞侵襲實驗，評價各轉(zhuǎn)染組對Hep G2遷移的影響

轉(zhuǎn)染后的Hep G2細胞消化下來后，用含0.1%胎牛血清培養(yǎng)基重懸，接種于Transwell小室中，細胞密度控制在1×105和5×105／ml之間。小室預(yù)先用濃度0.3 mg／ml matrigel鋪膠。小室下層加入含10%胎牛血清作為趨化因子。置37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h后，用棉簽小心擦去小室上層未穿過去的細胞和matrigel膠。冰上預(yù)冷的甲醇固定，龍膽紫和伊紅染色。置于相差顯微鏡下觀察小室下層穿過的細胞，計數(shù)，每組隨機取3個視野。

2.3 免疫共沉淀法檢測各組整合素α3、α6的表達

用六孔板培養(yǎng)Hep G2細胞，轉(zhuǎn)染細胞48h后，小心棄去細胞培養(yǎng)基，每孔加入100μl RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min后，用細胞刮子刮下，收集到EP管中，4℃離心機12，000×g離心20 min，上清即為蛋白液。每1 ml細胞裂解液加入20μl蛋白A／G瓊脂糖混懸液，4℃搖床上孵育10 min。4℃14，000×g離心5 min以去除蛋白A／G瓊脂糖，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中。加入5C11抗體后4℃搖床上過夜。加入蛋白A／G瓊脂糖30-40μl，4℃搖床上輕輕混合2h，離心取沉淀，加入40μl SDS上樣緩沖液混勻。沸水中煮10 min，離心取上清各取20μl，通過10%SDS／PAGE凝膠電泳分離。4℃條件下在轉(zhuǎn)膜緩沖液（Tris-HCL25 mmol／L，甘氨酸192 mmol／L，20%甲醇）中200 mA穩(wěn)流維持90 min將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用含20%脫脂牛奶的TBST緩沖液（Tris-HCL10 mmol／L，NaCL150 mmol／L，0.05%Tween 20）封閉2.5h后，將膜放入含有相應(yīng)一抗稀釋液中4℃孵育過夜。TBST洗膜6次，每次10 min，將膜與標記有辣根過氧化物酶的二抗（1：8000稀釋）室溫下孵育2.5h，用TBST洗膜6次，每次10 min。膜與ECL試劑反應(yīng)1 min后，X光片壓片曝光。

3.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)，兩組之間比較用t檢驗，三組及以上用單因素方差分析檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.p AAV-CD151 及 p AAV-CD151-AAA 對Hep G2細胞增殖的影響

p AAV-CD151轉(zhuǎn)染組能顯著促進Hep G2細胞增殖，而 p AAV-CD151-AAA 促 細 胞 增 殖 能 力 低 于p AAV-CD151組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 用CCK-8試劑檢測各組在450nm處的光密度數(shù)值Fig.1 Using CCK-8 to detect the optical density value of different groups.＊P＜0.05 vs.GFP and control groups.△P＜0.05 vs CD151 group.

2.p AAV-CD151 及 p AAV-CD151-AAA 對Hep G2細胞侵襲力的影響

p AAV-CD151轉(zhuǎn)染組增強Hep G2的侵襲，而p AAV-CD151-AAA組未見細胞侵襲的增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

3.免疫共沉淀法檢測各組整合素α3、α6的表達

p AAV-CD151轉(zhuǎn)染組免疫共沉淀法檢測到整合素α3、α6的表達，而p AAV-CD151-AAA 組未檢測到整合素α3、α6的表達（圖3）。

討 論

癌癥是嚴重危害人類健康的疾病之一，我國每年新增腫瘤患者260萬。長期以來，腫瘤患者的臨床治療一直遵循著這樣一條路線，手術(shù)—放療—化療，這也是目前醫(yī)學(xué)界一致認同的比較成熟的治療手段。然而在這樣的治療方式下，我國腫瘤患者5年生存率不到20%。放、化療是一把雙刃劍，在殺死腫瘤細胞的同時，也摧毀自身的免疫系統(tǒng)，更容易促使腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移擴散。

有沒有更好的方法，既能準確殺死腫瘤細胞，同時又不損害自身的免疫系統(tǒng)，有效阻止腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和擴散，這是全世界腫瘤科學(xué)家研究的方向，也是治療腫瘤的根本出路。

目前臨床腫瘤學(xué)的主要進展是分子靶向治療。最新的一些研究發(fā)現(xiàn)CD151在各種腫瘤細胞中都發(fā)揮重要作用。CD151是四跨膜蛋白超家族中的重要分子，其含有四個跨膜區(qū)：一個小的細胞內(nèi)環(huán)，胞內(nèi)N-末端、C-末端和兩個大的細胞內(nèi)環(huán)［3］。文獻報道，在肝細胞肝癌患者中CD151中高表達，且這種高表達與病人預(yù)后差密切相關(guān)［4］。CD151與腎臟上皮細胞癌的臨床分級相關(guān)，CD151表達水平高的患者其生存率顯著降低［5］。在消化道腫瘤，研究發(fā)現(xiàn)CD151表達水平高的患者其遠處轉(zhuǎn)移率增加［6］。罹患子宮內(nèi)膜癌的患者，CD151可能可以作為診斷預(yù)后的新指標［7］。CD151可與c-met分子形成復(fù)合體增強人唾液腺癌細胞的致瘤性［8］。CD151高表達與乳腺癌患者，與乳腺癌進展密切相關(guān)［9］。對低分化前列腺癌患者來說，CD151指導(dǎo)其預(yù)后甚至優(yōu)于組織學(xué)分級［10］?？偠灾珻D151對于多種類別的腫瘤患者來說是一個“壞分子”。臨床上對于CD151與腫瘤的預(yù)后研究甚多，但其細胞水平研究偏少。以往的資料顯示CD151發(fā)揮重要的作用都需要其他四跨膜蛋白或非四跨膜蛋白分子的協(xié)同，整合素是非四跨膜蛋白中最重要的分子，其中最主要的整合素分子是α3β1 和α6β1［11］。Kazar ov等發(fā)現(xiàn)CD151胞外環(huán)194-196是其與整合素α3、α6結(jié)合的決定性的位點［12］?；诖耍瑢嶒灢捎们捌谝褬?gòu)建好 的 CD151-AAA 突 變 體 （QRD194-196 →AAA194-196）轉(zhuǎn)染 Hep G2細胞，觀察到突變體轉(zhuǎn)染的細胞其增殖力，侵襲力均較CD151組降低。說明CD151體外促腫瘤轉(zhuǎn)移依賴于整合素α3／α6-CD151復(fù)合體的形成，可能為今后臨床上切斷腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的研究提供一個新的方向。

［1］Caplan MJ，Ka msteeg EJ，Duffield A.Tetraspan proteins：regulators of renal str uct ure and f unction.Curr Opin Nephr ol Hypertens，2007，16（4）：353-358

［2］Takeda Y，Kazarov AR，Butterfield CE，et al.Deletion of tetraspanin CD151 results in decreased pathologic an-giogenesis in vivo and in vitro.Blood，2007，109（4）：1524-1532

［3］Zheng ZZ，Liu ZX.Activation of t he phosphatidylinositol 3-kinase／protein kinase Akt pathway mediates CD151-induced endothelial cell proliferation and cell migration.Int J Biochem Cell Biol，2007，39（2）：340-348

［4］Devbhandari RP，Shi GM，Ke A W，et al.Pr ofiling of the tetraspanin CD151 web and conspiracy of CD151／integrin beta1 co mplex in t he progression of hepatocellular carcino ma.PLoS ONE，2011，6（9）：e24901

［5］Yoo SH，Lee K，Chae JY，et al.CD151 expression can predict cancer progression in clear cell renal cell carcinoma.Histopathology，2011，58（2）：191-197

［6］Zoller M.Gastrointestinal t u mors：metastasis and tetraspanins.Z Gastroenterol，2006，44（7）：573-586

［7］Voss MA，Gordon N，Maloney S，et al.Tetraspanin CD151 is a novel prognostic mar ker in poor outcome endometrial cancer.Br J Cancer，2011，104（10）：1611-1618

［8］Klosek SK，Nakashir o K，Hara S，et al.CD151 f or ms a f unctional co mplex with c-Met in hu man salivary gland cancer cells.Biochem Biophys Res Commun，2005，336（2）：408-416

［9］Yang XH，Richardson AL，Torres-Arzayus MI，et al.CD151 accelerates breast cancer by regulating alpha 6 integrin f unction，signaling，and molecular organization.Cancer Res，2008，68（9）：3204-3213

［10］Ang J，Lijovic M，Ash man LK，et al.CD151 protein expression predicts t he clinical outco me of low-grade pri mar y prostate cancer better than histologic grading：a new prognostic indicator？Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13（11 Pt 1）：1717-1721

［11］Zoller M.Tetraspanins：push and pull in suppressing and pro moting metastasis.Nat Rev Cancer，2009，9（1）：40-55

［12］Kazarov AR，Yang X，Stipp CS，et al.An extracellular site on tetraspanin CD151 deter mines alpha 3 and alpha 6 integrin-dependent cellular morphology.J Cell Biol，2002，158（7）：1299-1309

Function of integrinα3 andα6 in the proliferation and invasion of Hep G2 cells promoted by CD151

Fei Yujie，Zuo Houjuan，Qin Jin，Zeng Hesong＊，Liu Zhengxiang＊
（Depart ment of car diology，Tongji Hospital，Tongji Medical college，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

Objective To obser ve t he pr olif eration and invasion of p AAV-CD151 transfected Hep G2 cells，and its correlation with the integrins.Methods Using Liposome transfection reagents，plasmid CD151 and CD151-AAA mutant were transfected into Hep G2 cell.We obser ved the pr olif eration and invasion and used co-i mmunoprecipitation assay to detecte t he expression of integrins.Results Co mpared with that of CD151，the ability of CD151-AAA mutant to promote cell proliferation decreased，and there was no enhanced invasiveness.Co-i mmunoprecipitation f ailed to detect t he expression of integrins.Concl usion CD151 i mproves proliferation and invasion of Hep G2 cells，depending on the f or mation of the CD151-integrinα3／α6 co mplex.

Pr oliferation；Transwell；CD151；CD151-AAA

R735.7

A

10.3870／zgzzhx.2012.02.001

2011-02-10

2011-04-01

國家自然科學(xué)青年基金資助（81000047，8100-0139）；高等院校博士學(xué)科點專項科研基金新教師基金（200804871035）

費宇杰，女（1983年），漢族，博士生。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）