龔 鑫 熊克仁＊ 汪仁平

揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)NOS、ACh E陽性神經(jīng)元的分布

龔 鑫1熊克仁1＊汪仁平2

（1皖南醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，蕪湖241002；2安徽省揚(yáng)子鱷繁殖研究中心，宣城242000）

目的 觀察揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，ACh E）陽性神經(jīng)元的形態(tài)和分布，為揚(yáng)子鱷腦的比較解剖學(xué)積累資料，為其機(jī)能研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。方法 采用還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶（NADPH-d）法和亞鐵氰化酮法觀察揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)NOS和ACh E陽性神經(jīng)元的分布和特征。結(jié)果 揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)有NOS和ACh E陽性神經(jīng)元分布，為大、中、小型細(xì)胞，以中小型細(xì)胞為主，胞體呈圓形、橢圓形、三角形和梭形。結(jié)論 揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)有NOS和ACh E陽性神經(jīng)元分布。

新皮質(zhì)；一氧化氮合酶；乙酰膽堿酯酶；揚(yáng)子鱷

揚(yáng)子鱷是我國特有的珍稀野生動(dòng)物，是全球23種鱷魚中最瀕危的鱷類，已被列為國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物。它在進(jìn)化過程中處于由水生到陸生的關(guān)鍵過渡階段，對(duì)其神經(jīng)系統(tǒng)的研究具有重要的意義。新皮質(zhì)作為揚(yáng)子鱷端腦的重要組成部分之一，其內(nèi)NOS和ACh E陽性神經(jīng)元的分布尚未見有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用組織化學(xué)的方法對(duì)其新皮質(zhì)內(nèi)NOS和ACh E陽性神經(jīng)元的分布進(jìn)行研究，為進(jìn)一步了解揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)的功能提供基礎(chǔ)形態(tài)學(xué)資料。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7歲齡揚(yáng)子鱷5條，由安徽省揚(yáng)子鱷繁殖研究中心提供。

2.方法

揚(yáng)子鱷處死后立即斷頭取腦，入含20%蔗糖的固定液（2%多聚甲醛、1.25%戊二醛的0.1 mol／L磷酸緩沖液p H 7.4）內(nèi)，4℃冰箱過夜，待組織下沉后冰凍切片，片厚40μm，切片分成兩套，第一套切片用0.01 mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）接片，洗滌3次，每次3 min；切片入孵育液（為含1g／L NADPH-d、1.2 mmol／L NBT 和0.3%Triton X-100的0.1 mol／L磷酸緩沖液）中，37℃溫箱孵育1h，反應(yīng)結(jié)束后，將切片移入PBS（p H 7.4）內(nèi)清洗3次，每次3 min，貼片、干燥、脫水、透明、封片、顯微鏡下觀察。第二套切片用0.01 mol／L PBS接片，經(jīng)雙蒸水清洗2次，每次3 min，然后浸入反應(yīng)液（含①醋酸鹽緩沖液p H5.5，6.5 ml；②0.1 mol／L檸檬酸鈉0.5 ml；③30 mmol／L硫酸銅1 ml；④雙蒸水1 ml；⑤5 mmol／L鐵氰化鉀1 ml。依次加入各液體，最后將碘化硫代乙酰膽堿5 mg溶于上述液體中即成為反應(yīng)液），在37℃溫箱內(nèi)孵育1h，反應(yīng)結(jié)束后將切片移入雙蒸水內(nèi)清洗2次，每次3 min，貼片、干燥、脫水、透明、封片，采用讀數(shù)顯微鏡和黑馬病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞大小及形態(tài)特征的觀察。

3.細(xì)胞大小的劃分

胞體直徑在10μm以下的細(xì)胞為小型細(xì)胞，直徑在10-20μm之間的細(xì)胞為中型細(xì)胞，直徑在20μm以上的細(xì)胞為大型細(xì)胞［1］。

4.統(tǒng)計(jì)處理與分析

用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)值變量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05作為判定有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的依據(jù)。

結(jié) 果

1.揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)NOS陽性神經(jīng)元的分布及特征

NOS陽性神經(jīng)元胞質(zhì)和突起被染成紫藍(lán)色，胞核不著色或淡染呈空泡狀。揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)有NOS陽性神經(jīng)元分布，細(xì)胞染色較深，細(xì)胞大小以中小型細(xì)胞為主，可見少量大型細(xì)胞，胞體和突起清晰，突起較長，胞體以橢圓形最為多見，圓形、三角形和梭形三種細(xì)胞數(shù)大致相當(dāng)（圖1、2）。隨機(jī)選取20張新皮質(zhì)切片，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)（表1、2）。

2.揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)ACh E陽性神經(jīng)元的分布及特征

ACh E陽性反應(yīng)物為棕色沉淀，因此ACh E陽性神經(jīng)元的胞質(zhì)和突起呈棕紅色，胞核染色較淡或不著色。揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)可見到較為密集的ACh E陽性神經(jīng)元，以中小型細(xì)胞為主，胞體和突起清晰，突起較長，胞體以三角形、橢圓形多見，另可見少量圓形和梭形細(xì)胞（圖3、4）。隨機(jī)選取20張新皮質(zhì)切片，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)（表1、2）。

圖1 新皮質(zhì) NOS陽性神經(jīng)元 ×40 Fig.1 NOS positive neurons in the neocortex×40圖2 新皮質(zhì) NOS陽性神經(jīng)元 ×100 Fig.2 NOS positive neurons in t he neocortex×100圖3 新皮質(zhì) ACh E陽性神經(jīng)元 ×40 Fig.3 ACh E positive neurons in the neocortex×40圖4 新皮質(zhì) ACh E陽性神經(jīng)元 ×100 Fig.4 ACh E positive neurons in the neocortex×100

表1 揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)NOS、ACh E陽性神經(jīng)元大小分布（ˉx±s）Table 1 The size of NOS and ACh E positive neurons in the neocortex of Alligator sinensis（ˉx±s）

表2 揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)NOS、ACh E陽性神經(jīng)元形態(tài)分布（ˉx±s）Table 2 Table 2 The shape of NOS and ACh E positive neur ons in the neocortex of Alligator sinensis（ˉx±s）

討 論

從低等脊椎動(dòng)物開始，端腦的內(nèi)側(cè)壁上份是海馬，前下方是隔，外側(cè)壁稱梨狀皮質(zhì)，下壁是紋狀體，爬行類動(dòng)物由于紋狀體增厚，向側(cè)腦室內(nèi)隆突，側(cè)腦室頂部的細(xì)胞向腦表遷移形成新皮質(zhì)。同其它爬行動(dòng)物相似，揚(yáng)子鱷大腦半球被側(cè)腦室分為背側(cè)較薄的皮質(zhì)部和腹側(cè)較厚的基底部，其皮質(zhì)部可分為三部分，即內(nèi)側(cè)的海馬皮質(zhì)，背側(cè)的新皮質(zhì)，外側(cè)的梨狀皮質(zhì)［2］。在種系發(fā)生上，大腦皮質(zhì)一般分為新皮質(zhì)和異生皮質(zhì)，后者由古皮質(zhì)（海馬結(jié)構(gòu)）和舊皮質(zhì)（梨形葉）組成。隨著進(jìn)化的發(fā)展，到高等哺乳動(dòng)物，新皮質(zhì)高度增大，特別是人類的新皮質(zhì)高度發(fā)達(dá)，約占據(jù)全部皮質(zhì)的96%，分為額、頂、枕、顳、島葉。新皮質(zhì)與感覺和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的發(fā)展相伴隨，并與視覺、聽覺以及學(xué)習(xí)記憶等諸多功能有關(guān)［3］。

一氧化氮（NO）作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系，它已被證實(shí)是LTP（長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)）突觸機(jī)制中的一種必需的氣體信使分子，其主要作用是進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，對(duì)LTP的維持和長期記憶的形成至關(guān)重要［4］；NO還廣泛參與了視覺、聽覺等軀體感覺信息的形成、整合和傳遞［5，6］；NO可引起內(nèi)源性多巴胺釋放且呈正比關(guān)系，從而參與皮質(zhì)-紋狀體-丘腦-皮質(zhì)反饋抑制環(huán)路的調(diào)節(jié)及軀體運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)［7］。乙酰膽堿（ACh）是膽堿能神經(jīng)的化學(xué)遞質(zhì)，中樞膽堿能系統(tǒng)通過大腦皮質(zhì)和邊緣系統(tǒng)調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶過程［8］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)膽堿能系統(tǒng)與運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)，長期適量運(yùn)動(dòng)能提高皮質(zhì)與海馬內(nèi)膽堿能纖維密度［9］。本實(shí)驗(yàn)觀察到在揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)均有NOS、ACh E陽性神經(jīng)元分布，提示其內(nèi)的NO和ACh兩種神經(jīng)遞質(zhì)可能在揚(yáng)子鱷的學(xué)習(xí)記憶、軀體感覺信息的形成、整合和傳遞以及運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)活動(dòng)中發(fā)揮著作用。另外本實(shí)驗(yàn)觀察到，在揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)這兩種神經(jīng)元中ACh E陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯多于NOS陽性神經(jīng)元，我室曾觀察揚(yáng)子鱷大腦皮質(zhì)的其它兩個(gè)區(qū)域梨狀皮質(zhì)和海馬皮質(zhì)這兩種神經(jīng)元的分布，其中梨狀皮質(zhì)內(nèi)NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量較少、排列疏松，而ACh E陽性神經(jīng)元數(shù)量豐富，排列相對(duì)密集［10］；海馬皮質(zhì)內(nèi)ACh E陽性神經(jīng)元數(shù)量較多，NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量相對(duì)較少，ACh E陽性神經(jīng)元數(shù)量約為NOS的3.5倍，且排列密集［11］，與新皮質(zhì)內(nèi)這兩種神經(jīng)元分布情況相類似，ACh E陽性神經(jīng)元數(shù)量均明顯多于NOS陽性神經(jīng)元。提示在揚(yáng)子鱷大腦皮質(zhì)的功能調(diào)控中膽堿能神經(jīng)元可能發(fā)揮著主要的作用。

有研究報(bào)道，低等脊椎動(dòng)物魚類大腦皮質(zhì)的NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量較少，胞體主要呈圓形和三角形［12］，爬行動(dòng)物蛇類端腦背內(nèi)側(cè)部有少量的NOS陽性神經(jīng)元，胞體形態(tài)主要呈多角形和梭形［13］。在高等哺乳動(dòng)物中兔的大腦皮質(zhì)各個(gè)區(qū)域均可見到散在NOS陽性神經(jīng)元，NOS陽性神經(jīng)元胞體大小不一，可分為大、中、小3類，呈卵圓形、梭形、多角形［14］；小鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)可見到密集的、體積較小的NOS陽性細(xì)胞，胞體形態(tài)多數(shù)為錐形、星狀細(xì)胞，少數(shù)為橢圓形和梭形細(xì)胞［15］；另外在大鼠額葉皮質(zhì)中有ACh E陽性神經(jīng)元，細(xì)胞形態(tài)呈多角形、圓形、長橢圓形［16］。本研究中觀察到兩棲爬行動(dòng)物揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)有NOS和ACh E陽性神經(jīng)元分布，其中NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量較少，胞體形態(tài)有橢圓形、圓形、三角形和梭形，以橢圓形最為多見；ACh E陽性神經(jīng)元數(shù)量較多，排列較為密集，胞體以三角形、橢圓形多見，另可見少量圓形和梭形細(xì)胞。揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)與以上動(dòng)物大腦皮質(zhì)內(nèi)這兩種神經(jīng)元在數(shù)量和形態(tài)上的差異可能與物種及進(jìn)化程度的不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采取的是揚(yáng)子鱷大腦水平連續(xù)冰凍切片，是從新皮質(zhì)水平切面上觀察其內(nèi)NOS和ACh E陽性神經(jīng)元的大小和形態(tài)，能基本反映揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)這兩種神經(jīng)元的形態(tài)特征，如要更精確的測量和觀察揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)這兩種神經(jīng)元的大小和形態(tài)，還有待進(jìn)一步運(yùn)用三維重建圖像技術(shù)來進(jìn)行觀察。

有研究觀察到，在哺乳動(dòng)物兔腦內(nèi)NOS陽性神經(jīng)元的密度、第一級(jí)突起數(shù)和最長突起長度隨著年齡增長而逐漸減少，而胞體直徑卻隨年齡增長而逐漸增大［14］；在大鼠胚胎的第17天和20天及生后14天NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量逐漸增多，胞體增大，突起逐漸清晰，并相互交織成網(wǎng)［17］。在青年組（3-5月齡）和老年組（24-27月齡）大腦皮質(zhì)內(nèi)均可見到ACh E陽性神經(jīng)元和陽性纖維，青年組大鼠大腦皮質(zhì)ACh E陽性纖維粗長，且分布密集，交織成密網(wǎng)，纖維間聯(lián)系十分豐富，老齡組大鼠皮質(zhì)ACh E陽性纖維細(xì)短，纖維間聯(lián)系松散［18］。提示NO和ACh兩種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟和衰老過程中具有重要作用，NOS和ACh E陽性神經(jīng)元在不同的年齡揚(yáng)子鱷新皮質(zhì)內(nèi)數(shù)量、形態(tài)是否有變化，NO和ACh兩種神經(jīng)遞質(zhì)在揚(yáng)子鱷腦內(nèi)的發(fā)育、成熟和衰老過程中是否發(fā)揮著重要作用，還有待進(jìn)一步研究。

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Distribution of NOS and ACh E positive neurons in the neocortex of alligator sinensis

Gong Xin1， Xiong Keren1＊， Wang Renping2
（1Depart ment of Anatomy，Wannan Medical College，Wuhu 241002，2Anhui Research Centre of Alligator Sinensis Repr oduction，Xuancheng 242000，China）

Objective To observe the distribution of nitric oxide synthase（NOS）and acetylcholinesterase（ACh E）positive neur ons in t he neocortex of Alligator sinensis.Theref ore，to accu mulate data f or comparative anato my of Alligator sinensis＇brain，and to provide morphological foundation f or its f unctional research.Methods The nicotina mide adenosine dinucleotide phosphate diaphorase（NADPH-d）and acetylcholinesterase histochemical technique were used to obser ve t he distribution and mor phol ogy of NOS and ACh E positive neurons in the neocortex of Alligator sinensis.Results The NOS and ACh E positive neurons were obser ved in t he neocortex of Alligator sinensis.They were lar ge，middle or s mall sized cells，but most of them were middle and small.The cell bodies were round，oval，triangular or f usifor m in shape.Concl usion The neocortex of Alligator sinensis contains NOS and ACh E positive neur ons.

Neocortex；Nitric oxide synt hase；Acetylcholinesterase；Alligator sinensis

R

A

10.3870／zgzzhx.2012.02.016

2011-11-14

2012-02-20

皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項(xiàng)目資助（WK2006-09 A）

龔鑫，男（1979年），漢族，講師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）