李京敏 寧巍巍 劉同慎 王 東 白咸勇

TRAIL聯(lián)合順鉑對(duì)小鼠移植型肝癌抑制作用及機(jī)制研究

李京敏 寧巍巍 劉同慎 王 東 白咸勇＊

（濱州醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 山東煙臺(tái)264003）

目的 探討腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）聯(lián)合順鉑（cisplatin，DDP）對(duì)小鼠移植型肝癌的抑制作用及機(jī)制。方法 將H22小鼠移植型肝癌模型隨機(jī)分為生理鹽水組、TRAIL組、TRAIL＋DDP組和DDP組，稱取瘤重并分析抑瘤率，Hoechst 33342熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Caspase-3表達(dá)。結(jié)果 與生理鹽水組比較，TRAIL、DDP對(duì)小鼠移植型肝癌生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用（P＜0.05）；TRAIL與DDP聯(lián)合用藥具有增效作用（P＜0.05），可明顯提高肝癌細(xì)胞的凋亡率（P＜0.05）、上調(diào)Caspase-3表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論TRAIL與DDP聯(lián)合用藥對(duì)小鼠移植型肝癌生長(zhǎng)具有協(xié)同抑制作用，其機(jī)制可能與其協(xié)同促進(jìn)Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

肝癌；腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體；順鉑；Caspase-3

TRAIL是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族的新成員，可選擇性誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)正常組織及細(xì)胞無明顯毒副作用［1，2］。TRAIL的這種特殊生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)于臨床抗腫瘤治療具有重要意義。研究報(bào)道，TRAIL可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。一些腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL耐藥，但通過與化療藥物聯(lián)用可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性［3-6］。鑒于體內(nèi)腫瘤微環(huán)境與體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的差異，本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠原位移植型肝癌模型，采用TRAIL與DDP聯(lián)合用藥對(duì)肝癌的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制進(jìn)行了研究，以期為肝癌的臨床治療提供新的途徑。

1.材料

昆明小鼠購(gòu)自煙臺(tái)綠葉制藥有限公司，小鼠H22肝癌細(xì)胞株購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，人重組可溶性TRAIL由成都地奧制藥集團(tuán)有限公司惠贈(zèng)，注射用順鉑凍干型購(gòu)自齊魯制藥有限公司，Hochest33342購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗Caspase-3多克隆抗體，購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司。

2.動(dòng)物分組和模型制作

選取體重25g左右昆明小鼠40只，隨機(jī)分為4組：NS組、TRAIL組、TRAIL＋ DDP組、DDP組。將H22荷腹水瘤小鼠的腹水在小鼠腹腔內(nèi)連續(xù)傳代3次后，取腹水稀釋至細(xì)胞濃度2.5×107個(gè)／ml，用1 ml注射器注入模型小鼠肝左葉內(nèi)（體積最大），每只0.03 ml。手術(shù)后第6d開始給藥，采用腹腔注射0.01 ml／g動(dòng)物體重，分別給予 NS、80μg TRAIL／kg、3 mg DDP／kg、80μg TRAIL／kg ＋3 mg DDP／kg。每3d給藥1次，共6次。

3.標(biāo)本采集

最后一次給藥3d后脫頸處死小鼠，大體觀察肝臟，切取瘤塊，稱瘤重。4%多聚甲醛固定腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋。進(jìn)行4μm連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

4.Hoechst33342熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將4μm組織切片常規(guī)脫蠟至水，用PBS洗5 min，滴加Hoechst33342染液，避光作用10 min，甘油封片，使用共聚焦激光掃描顯微鏡紫外光（360nm）激發(fā)，顯示為明亮的藍(lán)色熒光。凋亡細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn)：胞核中染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮、熒光增強(qiáng)，細(xì)胞核裂解為碎片或者出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上的熒光碎片判為凋亡細(xì)胞。每張切片觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)。

5.Caspase-3免疫組織化學(xué)染色（SP法）

將4μm組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫甲醇處理30 min，檸檬酸緩沖液微波修復(fù)10 min，正常羊血清封閉30 min，滴加兔抗Caspase-3多克隆抗體（1：200）4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記羊抗兔Ig G 37℃孵育30 min，DAB顯色。陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)或胞核內(nèi)有彌漫分布的棕黃色顆粒沉積。圖片采用I MAGE-PROPLUS圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均光密度值表示。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（ˉx±s）表示，采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行析因設(shè)計(jì)方差分析和Bonf err oni法兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.肝臟病理學(xué)變化

肉眼觀，可見模型小鼠肝左葉有類圓形白色結(jié)節(jié)形成，呈膨脹性-浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與周圍組織邊界清楚。光學(xué)顯微鏡下觀察，可見腫瘤組織呈團(tuán)塊狀生長(zhǎng)，周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；在高倍鏡下觀察，腫瘤細(xì)胞異型性明顯，核大，有多個(gè)核仁，可見瘤巨細(xì)胞和核分裂相，腫瘤中心可見大片壞死。（圖1）。

2.瘤重及抑瘤率分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TRAIL與DDP單獨(dú)用藥組的瘤重均低于NS組瘤重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TRAIL與DDP聯(lián)合用藥對(duì)肝癌生長(zhǎng)抑制具有交互作用，與TRAIL組、DDP組瘤重比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明兩者聯(lián)用能夠協(xié)同抑制小鼠移植型肝癌生長(zhǎng)。

表1 各組瘤重及抑瘤率比較（n＝5，ˉx±s）Table 1 Comparison of tu mor weight and inhibitor y rate in different gr oups（n＝5，ˉx±s）

3.Hoechst 33342染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TRAIL組、DDP組凋亡細(xì)胞數(shù)均高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TRAIL和DDP聯(lián)合用藥具有交互作用，能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2）

4.Caspase-3的表達(dá)

光學(xué)顯微鏡下觀察：各用藥組癌組織中均可見大量Caspase-3陽性表達(dá)癌細(xì)胞，這些癌細(xì)胞體積較大，核大，胞質(zhì)少。（圖3）TRAIL與DDP單獨(dú)用藥組癌組織內(nèi)Caspase-3的表達(dá)均高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；TRAIL和DDP聯(lián)合用藥對(duì)Caspase-3在癌組織的表達(dá)有交互作用（P＜0.01），兩種藥物聯(lián)用對(duì)Caspase-3的表達(dá)增高有協(xié)同作用（P＜0.01）。

表2 各組細(xì)胞凋亡數(shù)比較（n＝5，ˉx±s）Table 2 Co mparison of apoptotic cells in different groups（n＝5，ˉx±s）

表3 Caspase-3在各組癌組織中的表達(dá)（ˉx±s）Table 3 Expression of Caspase-3 in cancer tissues in different groups（ˉx±s）

圖1 小鼠肝臟病理學(xué)變化（HE染色）圖2 Hoechst 33342染色結(jié)果。×1000圖3 Caspase-3在癌組織中的表達(dá)。（SP法 ×400）Fig.1 The pathological changes of liver tissues in mice（HE stainning）；1 A：Nor mal liver tissues（HE stainning ×100）；1B：Nor mal liver tissues（HE stainning ×400）；1C：Liver cancer tissues（HE stainning ×100）；1D：Liver cancer tissues（HE stainning×400）Fig.2 Result of Hoechst 33342 staining.×1000；2A：NS group；2B：TRAIL group；2C：DDP group；2D：TRAIL＋DDP groupFig.3 Expression of caspase-3 in cancer tissues.（SP method×400）；3A：NS group；3B：TRAIL group；3C：DDP group；3D：TRAIL＋DDP group

討 論

研究表明，TRAIL對(duì)大部分腫瘤細(xì)胞有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用，但大多數(shù)肝癌細(xì)胞系對(duì)TRAIL具有耐藥性。Shin［7］等單獨(dú)用TRAIL處理肝細(xì)胞肝癌（HCC）細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎所有的細(xì)胞系均對(duì)TRAIL表現(xiàn)耐藥，但TRAIL與DDP聯(lián)合用藥，可增加HCC對(duì)TRAIL的敏感性；TRAIL與化療藥物聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞具有更顯著的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用［8，9］。在體內(nèi)，腫瘤細(xì)胞增殖與宿主代謝以及體內(nèi)藥物的相互作用相當(dāng)復(fù)雜，并受多種因素調(diào)控，而且肝內(nèi)的免疫環(huán)境非常復(fù)雜。鑒于此，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TRAIL組的瘤重及抑瘤率與NS對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明TRAIL對(duì)肝癌生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但與傳統(tǒng)化療藥物DDP相比，其單一用藥治療效果不理想。這可能與體內(nèi)腫瘤微環(huán)境較為復(fù)雜有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TRAIL與DDP聯(lián)用組與其他三組比較，對(duì)小鼠移植型肝癌生長(zhǎng)具有更明顯抑制作用，TRAIL與DDP配伍有增效作用，可明顯提高肝癌細(xì)胞的凋亡率、上調(diào)肝癌細(xì)胞 Caspase-3的表達(dá)。Siervo［10］等研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL和順鉑聯(lián)合用藥能夠協(xié)同上調(diào)卵巢癌細(xì)胞TRAIL受體DR4、DR5的表達(dá)、下調(diào)Dc R1的表達(dá)、協(xié)同下調(diào)抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2和Bcl-x L 的 表 達(dá)、促 進(jìn) Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-10活化，從而增加了卵巢癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。TRAIL主要是通過與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。TRAIL與死亡受體DR4、DR5特異性結(jié)合后通過死亡結(jié)構(gòu)域激發(fā)和傳遞凋亡信號(hào)，激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后激活Caspase-3，活化的Caspase-3作用于其效應(yīng)物并引發(fā)細(xì)胞凋亡發(fā)生［11］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為TRAIL和順鉑聯(lián)用可通過協(xié)同上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，提高肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。這為TRAIL與順鉑兩者之間的配伍應(yīng)用于臨床提供了進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。我們將研究TRAIL與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)小鼠移植型肝癌細(xì)胞TRAIL受體以及其它凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為TRAIL應(yīng)用于臨床治療肝癌提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Inhibitory action and mechanism of trail combined with cisplatin on transplanted hepatocellular carcinoma in mice

Li Jing min，Ning Weiwei，Liu Tongshen，Wang Dong，Bai Xianyong＊
（Depart ment of Histology and Embr yol ogy，Binzhou Medical University，Shandong Yantai 264003，China）

Objective To st udy t he mechanis m and t he inhibitor y action of TRAIL co mbined wit h DDP on transplanted hepatocellular carcino ma in mice.Methods Mice bearing H22 hepatocellular carcinoma were rando mly divided into nor mal saline（NS）gr oup，TRAIL gr oup，TRAIL＋DDP gr oup，and DDP group.Tu mor tissues were weighted and the inhibitory rate was analysed.Hoechst 33342 stainning method was used to calculate t he apoptotic cells.The expression of Caspase-3 was measured by i mmunohistochemistry.Results Compared with NS，both TRAIL and DDP obviously inhibited the growth of transplanted hepatocell ular carcino ma in mice（P＜0.05）.They had a syner gistic effect（P＜0.05）and obviously increased the apoptotic rate of cancer cells（P＜0.05）and the expression of Caspase-3（P＜0.01）.Conclusion The co mbination of TRAIL wit h DDP has a syner gisticl y inhibitor y eff ect on t he gr owth of transplanted hepatocellular carcinoma in mice，and the mechanism may be associated with the synergistic upregulation of Caspase-3 expression.

Hepatocellular carcinoma；TRAIL；DDP；Caspase-3

R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.02.006

2011-02-10

2011-04-01

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金（01BS51）；山東省自然科學(xué)基金（Y2008C95）；濱州醫(yī)學(xué)院科技計(jì)劃（BY2008KJ27）

李京敏，女（1983年），漢族，碩士。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）