向招燕，李濤，余明華，李亞

動(dòng)脈導(dǎo)管未閉( patent ductus arteriosus，PDA) 是常見(jiàn)的先天性心臟病之一，大約占先天性心臟病的7% ～10%［1］。在足月兒中，其發(fā)病率為1/2000，男女比例為1:2［2］; 早產(chǎn)兒動(dòng)脈導(dǎo)管未閉的發(fā)生率較足月兒高，可達(dá)20%左右［3］;且胎齡和體重越小，發(fā)病率越高［4］。PDA 若未及時(shí)治療，常可誘發(fā)和促進(jìn)慢性肺疾病、顱內(nèi)出血、心力衰竭等疾病，是影響早產(chǎn)兒致殘率和死亡率的重要因素之一。但到目前為止，動(dòng)脈導(dǎo)管未閉的機(jī)制尚不十分明確。有研究顯示其與遺傳、缺氧、離子通道( 氧敏感性鉀通道) 、血管活性物質(zhì)( 前列腺素、內(nèi)皮素、血栓素) 等因素有關(guān)［5-7］。近年來(lái)，我們課題組研究表明氣體網(wǎng)絡(luò)分子系統(tǒng)［一氧化氮( NO) 、一氧化碳( CO) 、硫化氫( H2S) ］中的NO 和H2S 存在于動(dòng)脈導(dǎo)管組織中，并且在PDA 的發(fā)病機(jī)制中起到一定的作用［8］;亦有研究表明CO 在心血管系統(tǒng)中的功能與NO 相似，可以舒張血管，降低血管對(duì)收縮介質(zhì)的反應(yīng)。NO 在動(dòng)脈導(dǎo)管的舒張與收縮中發(fā)揮著作用，所以我們推測(cè)如果動(dòng)脈導(dǎo)管中存在CO 的表達(dá)，那么可能CO 也在動(dòng)脈導(dǎo)管的舒張與收縮中發(fā)揮著與NO 相似的功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 胎齡30 d 的日本大耳白兔孕兔( 由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供) ，體重2.5 ～5 kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK( 鄂)2011-0031。

1. 2 主要試劑 Trizol 試劑( Life Technologies，美國(guó)) ;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( Fermentas，美國(guó)) ;2* Taq PCR MasterMix( 天根生化科技，北京) ; 熒光定量PCR 試劑盒( Fermentas，美國(guó)) ;DL 1000 DNA Marker( TaKa-Ra，大連) ;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列:HO-2 引物序列上游引物: 5＇-AGC AGC ATA GTA GGG GCA TTT-3＇下游引物:5＇-ACC TGA ACC TGA AGA CCA AAG A-3＇，GAPDH 引物序列上游引物:5＇-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3＇ 下游引物: 5＇-GGT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3＇，引物均由上海生工生物工程;RIPA 裂解液( 強(qiáng)) ( Beyotime，上海) ;BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒( 天根生化科技，北京) ; 一抗兔抗兔HO-2( abcam，美國(guó)) ; 內(nèi)參小鼠抗兔B-actin( Beyotime，上海) ;二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔( 鼎國(guó)，北京) ;Prestained Protein ladder( Fermentas，美國(guó)) ;內(nèi)源性一氧化碳試劑盒( 南京建成) ; 其余試劑為國(guó)產(chǎn)市售分析純?cè)噭?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 4 只孕齡為30 d 的的日本大耳白兔，共產(chǎn)下24 只足月的仔兔( 平均每只產(chǎn)仔6 只) ，產(chǎn)下的仔兔立即固定于工作臺(tái)上，在無(wú)菌的條件下，分別取出仔兔動(dòng)脈導(dǎo)管組織(－80℃保存) 和新鮮心臟血，做好標(biāo)記，備用。

1.3.2 仔兔動(dòng)脈導(dǎo)管組織中HO-2 mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè) TRIzol 法抽提動(dòng)脈導(dǎo)管中HO-2 mRNA，BioPhotometer plus 核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)所提mRNA的濃度及純度( 總RNA OD260/OD280 均介于1.7 ～2.0 之間說(shuō)明提取的總RNA 質(zhì)量純，這也保證后面熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)的可靠性及可重復(fù)性) ，兩步法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進(jìn)行RT-PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)。所用引物均由上海生物工程有限公司合成。RT-PCR 反應(yīng)體系( 25μl 體系) : 按天根生化科技提供的步驟程序進(jìn)行操作，并設(shè)內(nèi)參對(duì)照( 內(nèi)參引物為GADPH) 。擴(kuò)增條件: 按天根生化科技提供的步驟程序進(jìn)行操作，退火溫度58℃，其他條件不變。在Biometra Tpersonal 型擴(kuò)增儀上擴(kuò)增，Touching 凝膠系統(tǒng)上分析結(jié)果。SYBR 熒光定量PCR 反應(yīng)體系(25μl 體系) :qPCR Master Mix(2X)12.5μL，Water nuclease-free10.5μL，cDNA1μL，上游引物0.5 μL，下游引物0. 5μL，并設(shè)內(nèi)參對(duì)照( 內(nèi)參引物為GADPH) 。擴(kuò)增條件:按Fermentas 公司提供的程序進(jìn)行操作，退火溫度58℃，其他條件不變。在ABI Prism 7500 型熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 仔兔動(dòng)脈導(dǎo)管組織HO-2 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算蛋白上樣量，SDS-PAGE 電泳分離( 濃縮膠恒壓100 V，1 h;分離膠恒壓120 V，3 h) 、轉(zhuǎn)膜( PVDF 膜，恒壓18 V，2 h) ，室溫封閉1 h，分別依次加入一抗兔抗兔HO-2抗體(1:1000) ，內(nèi)參小鼠抗兔β-actin 抗體(1:800) ，4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜，振洗后加入二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(1:5000) ;室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。振洗完，顯色后SYNGENE上分析結(jié)果。

1.3.4 胎兔血漿一氧化碳含量測(cè)定 按照南京建成生物工程所有限公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟操作，最后帶入公式計(jì)算。計(jì)算公式為:

Hb( g/L) =540nm 處吸光度值× 367. 7; Hb-CO% =〔0.822 ×△OD( A568－A581) +0.001〕×100%; 全血中CO 含量( μmol/L) = HbCO% × Hb( g/L) ×106 ×4/64456

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 仔兔動(dòng)脈導(dǎo)管組織中HO-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平 如圖1 所示: 各條帶清晰，無(wú)二聚體，說(shuō)明仔兔動(dòng)脈導(dǎo)管組織中存在HO-2 mRNA 的表達(dá)。如圖2 所示:仔兔動(dòng)脈導(dǎo)管組織中H0-2 蛋白的表達(dá)呈陽(yáng)性，從蛋白水平再次證實(shí)動(dòng)脈導(dǎo)管中存在HO-2 蛋白的表達(dá)。

圖1 動(dòng)脈導(dǎo)管組織中HO-mRNA 凝膠電泳圖( 各條帶清晰可見(jiàn)，無(wú)二聚體，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)良好，1-4 條帶是HO-2 的表達(dá)，大小為182bp;5-8 條帶是內(nèi)參GAPDH，大小為112bp，M 條帶為DNA Marker)

圖2 HO-2 的western blot 圖譜( 上面的條帶是內(nèi)參β-action，大小是42kD;下面的條帶為HO-2 蛋白的圖譜，大小是36kD)

2.2 仔兔動(dòng)脈導(dǎo)管組織中HO-2 mRNA 表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的結(jié)果 最終基因表達(dá)量用2-ΔΔCt 值表示，其中ΔΔCt =( HO-2mRNA Ct-GAPDH Ct) 實(shí)驗(yàn)組-( HO-2mRNA Ct-GAPDH Ct) 空白組，其表達(dá)量為0.33 ±0.11。

2.3 胎兔血漿一氧化碳含量測(cè)定結(jié)果 胎兔心臟全血中內(nèi)源性CO 的含量為53.09 ±6.73( μmol/L) 。

3 討論

CO 既往被認(rèn)為是有毒的氣體，但近年來(lái)，大量研究證實(shí)CO 與NO 相類似，即可以舒張血管，降低血管對(duì)收縮介質(zhì)的反應(yīng)。目前為止，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)CO的來(lái)源中有兩條途徑，一條途徑是吸入的氣體中含有少量CO( 外源性CO) ;另一條途徑是體內(nèi)生成的CO( 內(nèi)源性CO) 。內(nèi)源性CO 的產(chǎn)生至少有2 個(gè)途徑，大部分是在血紅素的代謝過(guò)程中產(chǎn)生的，即HO催化血紅素生成膽綠素、CO、Fe3+; 少量是通過(guò)微粒體脂質(zhì)的過(guò)氧化產(chǎn)生，但對(duì)其作用機(jī)制尚不清楚。研究表明CO 對(duì)大鼠主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、尾動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈以及犬的股動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈等都可以直接調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的舒縮狀態(tài)。Johnson 等［9］通過(guò)測(cè)定脈管擴(kuò)張流量和脈壓發(fā)現(xiàn)CO 減弱脈管系統(tǒng)的擴(kuò)張流量。HO 為內(nèi)源性CO 產(chǎn)生的限速酶，目前為止已經(jīng)證明HO 具有三種形式的同工酶:HO-1，HO-2，HO-3。HO-1 不僅對(duì)金屬，而且對(duì)引起氧化應(yīng)激和其它病理?xiàng)l件的所有刺激和化合物都十分敏感，Polizio 等［10］在果糖誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型中發(fā)現(xiàn)HO-1 在器官抗氧化防御酶系統(tǒng)活性完好的情況下能發(fā)揮降低血壓作用。Zhu 等［11］通過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CBS/H2S 和HO-1/CO 系統(tǒng)在心肌缺血再灌注中起協(xié)同保護(hù)作用。Ito 等［12］在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HO-1 可增加IL-10 的產(chǎn)生而降低肺動(dòng)脈高壓。Vera 等［13］發(fā)現(xiàn)HO-1 降低血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓，并且減少超氧化物的產(chǎn)生。Coceani 等［14］采用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)羊羔的動(dòng)脈導(dǎo)管進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)血紅素加氧酶-1 在內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞上都有表達(dá)，而血紅素加氧酶-2 只在平滑肌細(xì)胞表達(dá)。近年研究顯示，肺血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均有HO 蛋白及其活性的表達(dá)，是內(nèi)源性CO 生成和釋放的重要場(chǎng)所之一。

動(dòng)脈導(dǎo)管是一種特殊的血管，在出生后隨著肺呼吸、循環(huán)的建立，血氧張力提高，機(jī)體內(nèi)前列腺素迅速降解、緩激肽釋放等各種因素作用，促使動(dòng)脈導(dǎo)管關(guān)閉，而在這些因素中前列腺素E2( PGE2) 對(duì)維持動(dòng)脈開(kāi)放的作用最為重要［15］。Chang 等［16］對(duì)小鼠研究表明出生后前列腺素E2對(duì)動(dòng)脈導(dǎo)管的關(guān)閉與否起著關(guān)鍵作用。我們課題組發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2S( 內(nèi)源性氣體分子網(wǎng)絡(luò)中的一種) 不僅在大血管中能生成，而且在未出生的動(dòng)物的動(dòng)脈導(dǎo)管組織中也能產(chǎn)生，在動(dòng)脈導(dǎo)管組織中有胱硫醚-γ-裂解酶基因表達(dá)。大量研究表明CO 在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，與NO 類似，CO 也可以激活，升高胞漿中cGMP 水平，進(jìn)而舒張血管。本研究證實(shí)了動(dòng)脈導(dǎo)管中存在CO/HO-2，這為動(dòng)脈導(dǎo)管的舒張與收縮機(jī)制的研究擴(kuò)寬了領(lǐng)域。如果進(jìn)一步的研究能證明CO在動(dòng)脈導(dǎo)管的開(kāi)放與關(guān)閉機(jī)制中發(fā)揮著作用，那么CO 是通過(guò)什么途徑舒張動(dòng)脈導(dǎo)管的，這些內(nèi)容還有待進(jìn)一步的研究。

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