王 芳 孫 宇 朱汝南 趙林清 鄧 潔 廖 斌 黃榮妍 錢(qián) 淵

流感病毒是僅次于呼吸道合胞病毒(RSV)的可引起嬰幼兒急性呼吸道感染的常見(jiàn)重要病毒病原之一。流感病毒分甲(A)、乙(B)和丙(C)3 個(gè)型別。目前，感染人類(lèi)的甲型流感病毒根據(jù)抗原性和基因特征分為甲1(H1N1)和甲3(H3N2)型，乙型流感病毒分為Victoria 和Yamagata 兩大譜系。甲型流感病毒抗原變異活躍，可引起世界范圍的大流行。而乙型流感病毒感染和傳播的嚴(yán)重程度不如甲型流感病毒，但也常引起小規(guī)模的暴發(fā)流行［1，2］。在流感的流行季節(jié)，往往因急性呼吸道感染而發(fā)熱的就診患兒驟增，臨床上需要快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便和適用于臨床應(yīng)用的流感病毒病原診斷方法，以便對(duì)出現(xiàn)流感樣癥狀的患兒及早做出正確的病原診斷，采取恰當(dāng)?shù)闹委煼桨?。目前有一些可用于臨床實(shí)驗(yàn)室快速診斷呼吸道病毒的方法［3］，如檢測(cè)抗原的有ELISA、免疫熒光法;檢測(cè)病毒核酸的有PCR、RTPCR 等，上述方法經(jīng)過(guò)了與經(jīng)典病毒學(xué)方法(如病毒分離法)的大量比較，證明其敏感、特異和可靠，但需要特殊的儀器設(shè)備和經(jīng)特殊培訓(xùn)的技術(shù)人員，而且檢測(cè)所需要的時(shí)間較長(zhǎng)，因此不宜在臨床、尤其是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用推廣。目前一些更加簡(jiǎn)便快速的診斷方法被陸續(xù)推出［4］。用膠體金、膠乳免疫層析法來(lái)進(jìn)行抗原檢測(cè)的方法逐漸應(yīng)用于呼吸道病毒的檢測(cè)，這些方法檢測(cè)時(shí)間短，標(biāo)本采集后8 ～15 min 便可用肉眼觀察結(jié)果，不需要特殊設(shè)備，有望在臨床實(shí)驗(yàn)室甚至在基層的社區(qū)醫(yī)院推廣。本研究報(bào)道了一種已在國(guó)外臨床使用的流感病毒抗原快速檢測(cè)方法在兒科流感樣病例病原診斷中的應(yīng)用結(jié)果，并將該方法與流感病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)——病毒分離法進(jìn)行比較分析。

1 方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2010 年12 月至2011 年4 月根據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部頒布的《流行性感冒診斷與治療指南(2011 年版)》從首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院門(mén)診采集發(fā)病3 d 內(nèi)的流感樣病例(即體溫≥38℃，伴咳嗽、咽痛或流涕癥狀之一，同時(shí)缺乏其他實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù))的14 歲以下患兒的咽拭子標(biāo)本。流感樣病例的納入和標(biāo)本采集由經(jīng)培訓(xùn)的臨床醫(yī)生負(fù)責(zé)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法 ①流感病毒抗原檢測(cè)采用甲型和乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒，以推薦的流感病毒檢測(cè)的病毒分離法［《流行性感冒診斷與治療指南(2011 年版)》］為對(duì)照方法，并檢測(cè)該試劑盒與其他常見(jiàn)的呼吸道病毒之間的交叉反應(yīng)性。每次采集的標(biāo)本在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行抗原快速診斷(8 min 出結(jié)果);②病毒分離法則是將標(biāo)本收集后于當(dāng)日進(jìn)行細(xì)胞接種(幾天至2 周出結(jié)果)。③對(duì)于抗原檢測(cè)和病毒分離法結(jié)果不相符的咽拭子標(biāo)本集中采用RT-PCR方法驗(yàn)證。三部分實(shí)驗(yàn)由不同的實(shí)驗(yàn)人員操作。

1.3 標(biāo)本采集方法 同時(shí)用兩支無(wú)菌粘膠纖維采樣拭子(Copan 公司，意大利)對(duì)有流感樣癥狀的就診患兒采集咽拭子標(biāo)本，其中一支拭子放入病毒采樣液中立刻置于冰壺，用于病毒分離(需要時(shí)行RT-PCR 驗(yàn)證)，另一支拭子即刻在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行流感病毒抗原的快速診斷。

1.4 流感病毒抗原檢測(cè) 使用甲型和乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒(QuickNaviTM-Flu，生研公司產(chǎn)品，日本)膠乳免疫層析法對(duì)咽拭子標(biāo)本進(jìn)行抗原檢測(cè)。使用該試劑盒時(shí)將樣品滴加在檢測(cè)卡的樣品孔中，樣品通過(guò)毛細(xì)管現(xiàn)象移動(dòng)至結(jié)合墊，溶解此處的抗甲型及抗乙型抗體結(jié)合乳膠，與樣品中的甲型或乙型抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物。該免疫復(fù)合物通過(guò)毛細(xì)管現(xiàn)象移動(dòng)至試紙的薄膜內(nèi)，被固定在測(cè)試帶上的抗甲型或抗乙型抗體特異性捕捉，甲型呈紅色帶狀、乙型呈藍(lán)色帶狀。該試劑盒可以使用一個(gè)檢測(cè)卡同時(shí)檢測(cè)標(biāo)本中的甲型或乙型流感病毒抗原。標(biāo)本采集和加樣嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，于加樣后8 min 肉眼判定檢測(cè)結(jié)果。

1.5 病毒分離法 咽拭子標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理后，接種于傳代狗腎細(xì)胞(MDCK)，置33℃恒溫室培養(yǎng)。用于病毒分離的維持液含有2 μg·mL－1的TPCK 處理的胰酶(Sigma 公司，美國(guó))。逐日觀察細(xì)胞病變，自標(biāo)本接種后第3 日起每隔2 d 用0.75%的豚鼠血細(xì)胞進(jìn)行血細(xì)胞凝集試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)血凝試驗(yàn))。血凝試驗(yàn)陽(yáng)性的培養(yǎng)液進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)鑒定型別。第1 代病毒分離的細(xì)胞上清血凝試驗(yàn)陰性者行盲傳培養(yǎng)。傳第2 代培養(yǎng)仍為陰性者判定為病毒分離陰性。

1.6 流感病毒分離株型別鑒定 血凝試驗(yàn)陽(yáng)性的培養(yǎng)上清中血凝滴度以(+ +)凝集的病毒，最高稀釋度的倒數(shù)為1 個(gè)血凝單位。制備4 個(gè)血凝單位作為抗原，用血凝抑制試驗(yàn)鑒定流感病毒亞型［甲1(原季節(jié)性H1N1)、H3N2、乙型(Victoria 和Yamagata 系)、2009 甲型H1N1］。用于分離株型別鑒定的流感病毒特異性分型血清為WHO 的流感病毒參考血清，均由美國(guó)CDC 流感實(shí)驗(yàn)室提供。

1.7 標(biāo)本核酸提取 咽拭子標(biāo)本液(與病毒分離所用同一管)按常規(guī)處理并使用QIAamp?Viral RNA Mini Kit(Qiagen 公司)提取標(biāo)本中的核酸。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.8 RT-PCR 以中國(guó)國(guó)家流感中心提供的特異性引物和探針，參照中國(guó)流感中心下發(fā)的RT-PCR 方法，對(duì)抗原檢測(cè)與病毒分離法結(jié)果不相符的標(biāo)本進(jìn)行流感病毒核酸檢測(cè)和型別鑒定［2］。

1.9 QuickNaviTM-Flu 與其他常見(jiàn)呼吸道病毒之間的交叉反應(yīng)性 使用QuickNaviTM-Flu 檢測(cè)常見(jiàn)的其他6 種呼吸道病毒的培養(yǎng)物，包括RSV、腺病毒、副流感病毒1 ～3 型和人偏肺病毒的培養(yǎng)物(本實(shí)驗(yàn)室制備)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)QuickNaviTM-Flu 和病毒分離法的結(jié)果進(jìn)行Kappa 一致性檢驗(yàn)分析。Kappa 值≥0.75，表明兩者一致性較好;0.75 ＞Kappa 值≥0.4，表明兩者一致性一般;Kappa 值＜0.4，表明兩者一致性較差。

2 結(jié)果

本研究納入流感樣病例共350 例，其中男204 例，女146 例?；純耗挲g為1 個(gè)月至13 歲。所采集的咽拭子標(biāo)本同時(shí)進(jìn)入病毒抗原快速診斷和病毒分離法分析。

2.1 病毒分離結(jié)果 從350 例咽拭子標(biāo)本中分離到106株流感病毒，陽(yáng)性率為30.3%。經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)鑒定，其中8 株為乙型流感病毒(3 株Victoria 和5 株Yamagta 系毒株);98 株為甲型流感病毒(包括72 株H3N2，26 株2009 甲型H1N1)。流感病毒陽(yáng)性患兒中～6 歲組為46.2%，～3歲組為30.2%(表1)。

表1 不同型別流感病毒陽(yáng)性患兒的年齡分布［n(%)］Tab 1Age distribution of children infected by different type influenza viruses［n(%)］

2.2 標(biāo)本中流感病毒抗原檢測(cè)結(jié)果 350 例咽拭子標(biāo)本經(jīng)QuickNaviTM-Flu 試劑盒檢測(cè)，顯示102 例標(biāo)本為甲型流感病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性率為29.1%;7 例標(biāo)本為乙型流感病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性率為2.0%;總陽(yáng)性率為31.1% (109/350)。

2.3 流感病毒抗原檢測(cè)與病毒分離法結(jié)果比較

2.3.1 甲型流感病毒檢測(cè)結(jié)果比較 表2 顯示，88 例咽拭子標(biāo)本采用QuickNaviTM-Flu 檢測(cè)甲型流感病毒抗原與病毒分離法均為陽(yáng)性，10 例為抗原檢測(cè)陰性而病毒分離法陽(yáng)性，敏感度為89.8%(88/98);238 例用QuickNaviTM-Flu檢測(cè)甲型流感病毒抗原與病毒分離法均為陰性，14 例為抗原檢測(cè)陽(yáng)性而病毒分離法陰性，特異度為94. 4% (238/252)，總符合率為93.1%［(88 +238)/350］。一致性檢驗(yàn)顯示兩種方法的一致性好(Kappa=0.832，95%CI:0.767 ～0.897)。

表2 流感病毒抗原檢測(cè)和病毒分離法檢測(cè)甲型流感病毒比較(n)Tab 2Comparison of influenza virus A detection by QuickNaviTM-Flu and virus isolation(n)

2.3.2 乙型流感病毒檢測(cè)結(jié)果比較 表3 顯示，7 例咽拭子標(biāo)本用QuickNaviTM-Flu 檢測(cè)乙型流感病毒抗原與病毒分離法均為陽(yáng)性，1 例為抗原檢測(cè)陰性而病毒分離法陽(yáng)性，敏感度為87.5%(7/8);342 例用QuickNaviTM-Flu 檢測(cè)乙型流感病毒抗原和病毒分離法均為陰性，特異度為100%(342/342)，總符合率為99.7%［(7 +342)/350］。一致性檢驗(yàn)顯示兩種方法的一致性好(Kappa =0. 932，95% CI:0.799 ～1.066)。

表3 流感病毒抗原檢測(cè)和病毒分離法檢測(cè)乙型流感病毒比較(n)Tab 3Comparison of influenza virus B detection by QuickNaviTM-Flu and virus isolation(n)

2.3.3 甲型和乙型流感病毒總檢測(cè)結(jié)果比較 表4 顯示，QuickNaviTM-Flu 檢測(cè)甲型和乙型流感病毒抗原與病毒分離法的總敏感度為89.6%［(88 +7)/(98 +8)］，總特異度為94.3% (230/244)，總符合率為92.9%［(88 +7 +230)/350］。一致性檢驗(yàn)顯示兩種方法的一致性好(Kappa =0.832，95%CI:0.769 ～0.895)。

表4 流感病毒抗原檢測(cè)和病毒分離法檢測(cè)甲型和乙型流感病毒的比較(n)Tab 4Comparison of influenza virus A and B detection by QuickNaviTM-Flu and virus isolation(n)

2.3.4 RT-PCR 驗(yàn)證后結(jié)果比較 表5 顯示，QuickNaviTMFlu 檢測(cè)甲型流感病毒抗原陽(yáng)性而病毒分離法為陰性的14例標(biāo)本，經(jīng)RT-PCR 驗(yàn)證后13 例為陽(yáng)性，與QuickNaviTMFlu 結(jié)果一致，1 例仍為陰性;10 例病毒分離法陽(yáng)性而QuickNaviTM-Flu 檢測(cè)陰性標(biāo)本經(jīng)PCR 驗(yàn)證后均為陽(yáng)性。以RT-PCR 驗(yàn)證結(jié)果作為最終標(biāo)準(zhǔn)修正后，顯示敏感度、特異度和總符合率均有所升高(分別為91. 0%、99. 6% 和96.9%)，兩種方法的一致性也相應(yīng)升高(Kappa =0.926，95%CI:0.883 ～0.969)。

1 例病毒分離法為乙型流感病毒陽(yáng)性而QuickNaviTMFlu 檢測(cè)為陰性的標(biāo)本，經(jīng)RT-PCR 方法驗(yàn)證后為陽(yáng)性，因此QuickNaviTM-Flu 檢測(cè)乙型流感病毒的結(jié)果與未驗(yàn)證之前一致。

表5 經(jīng)RT-PCR 驗(yàn)證后QuickNaviTM-Flu 和病毒分離法檢測(cè)甲型流感病毒的比較(n)Tab 5Comparison of influenza virus A detection by QuickNaviTM-Flu and virus isolation verified by realtime RT-PCR(n)

2.4 與其他呼吸道病毒的交叉反應(yīng) 以其他常見(jiàn)的6 種呼吸道病毒的培養(yǎng)物作為待檢樣本，使用QuickNaviTM-Flu檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

3 討論

流感是全球傳染性較強(qiáng)的感染性疾病之一。由于流感病毒易發(fā)生抗原漂移，人群對(duì)流感病毒普遍易感。在歷史上，全球出現(xiàn)過(guò)數(shù)次流感大流行，最近一次發(fā)生的大流行于2009 年3 月首先在墨西哥暴發(fā)了甲型H1N1 流感，隨后迅速蔓延至世界各地，對(duì)公眾健康和社會(huì)造成了嚴(yán)重的危害，中國(guó)同樣也受到了波及［5］。研究顯示，0 ～3 歲嬰幼兒感染流感之后因嚴(yán)重并發(fā)癥導(dǎo)致住院的可能性與65 歲以上老年人相當(dāng)，屬于高危人群。同時(shí)學(xué)齡前和學(xué)齡期兒童往往是流感的第一受害者，并成為主要的傳播者之一［6］。因此流感樣病例的快速病原診斷非常重要，及時(shí)確診有利于正確的治療。

至今仍認(rèn)為流感病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為病毒分離法，但需要進(jìn)行細(xì)胞或雞胚分離培養(yǎng)，一般耗時(shí)3 ～7 d。流感病毒的快速診斷包括了抗原檢測(cè)和核酸檢測(cè)。核酸檢測(cè)需要對(duì)臨床標(biāo)本中的病毒核酸進(jìn)行提取、逆轉(zhuǎn)錄和目的基因的擴(kuò)增及檢測(cè)，一般耗時(shí)4 h 左右，并且需要在符合條件的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行?？乖瓩z測(cè)可采用免疫熒光法和免疫層析法檢測(cè)，耗時(shí)短。免疫熒光法需要特殊儀器及有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行結(jié)果判斷，而免疫層析法可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)特異性的抗原檢測(cè)，確定病原。本研究比較分析了利用免疫層析法對(duì)流感病毒進(jìn)行快速抗原檢測(cè)的方法在兒科流感樣病例病原診斷中的應(yīng)用效果。

QuickNaviTM-Flu 試劑盒只需單獨(dú)一個(gè)檢測(cè)卡即可在8 min 內(nèi)對(duì)甲型和乙型流感病毒進(jìn)行抗原診斷并分型，并且與其他常見(jiàn)的呼吸道病毒之間無(wú)交叉反應(yīng)。本研究顯示該方法與經(jīng)典的流感病毒培養(yǎng)的一致性好，其檢測(cè)甲型流感病毒的敏感度為89.9%，特異度為94.4%。經(jīng)RT-PCR 驗(yàn)證后，13/14 例抗原檢測(cè)和病毒分離法不相符樣本結(jié)果為陽(yáng)性(與抗原檢測(cè)結(jié)果一致)，使該抗原檢測(cè)方法的敏感度和特異度升至91.0%和99.6%?？乖瓩z測(cè)乙型流感病毒經(jīng)RT-PCR 驗(yàn)證前后的結(jié)果一致，因此檢測(cè)乙型流感病毒抗原的敏感度和特異度仍為87.5%和100%。病毒分離法結(jié)果顯示在陽(yáng)性標(biāo)本中包括了H3N3、乙型(Victoria 和Yamagata 系)和新發(fā)的2009 甲型H1N1，提示該試劑盒所提供的抗原檢測(cè)方法雖然不能對(duì)標(biāo)本中的流感病毒進(jìn)行亞型的鑒別，但是能夠很好地檢出目前在人類(lèi)流行的所有流感病毒亞型，包括2009 年新出現(xiàn)的豬源的發(fā)生人類(lèi)大流行的甲型H1N1。

QuickNaviTM-Flu 作為流感病毒抗原診斷的試劑盒，耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)便，具有良好的敏感度和特異度，在臨床病例的診斷、流感監(jiān)測(cè)和突發(fā)疫情時(shí)可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)流感疑似病例進(jìn)行病原的排查和確診。

［1］Wang F(王芳)，Zhu RN，Qian Y，et al. Surveillance for influenza B virus infections in infants and young children in Beijing，China. Chin J Pediatr(中華兒科雜志)，2008，46(2):94-97

［2］Zhu RN(朱汝南)，Qian Y，Wang F，et al. Surveillance for influenza A virus infections in infants and young children in Beijing，China，2001-2005. Chin J Pediatr(中華兒科雜志)，2006，47(11):518-522

［3］Yang JR，Lo J，Liu JL，et al. Rapid SYBR Green I and modified probe real-time RT-PCR assays identify influenza H1N1 viruses and distinguish between pandemic and seasonal strains. J Clin Microbiol，2009，47(11):3714-3716

［4］Hurt AC，Alexander R，Hibbert J，et al. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. J ClinVirol，2007，39(2):132-135

［5］Cao B，Li XW，Mao Y，et al. Clinical features of the initial cases of 2009 pandemic influenza A (H1N1)virus infection in China. N Engl J Med，2009，361(26):2507-2517

［6］Writing Committee of the WHO Consultation on Clinical Aspects of Pandemic (H1N1)2009 Influenza. Bautista E，Chotpitayasunondh T，Gao Z，et al. Clinical aspects of pandemic 2009 influenza A (H1N1)virus infection. N Engl J Med，2010，362(18):1708-1719