潘國(guó)剛， 羅 斌，滕元姬，梁麗娜

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西百色533000)

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種多基因、多因素綜合作用而導(dǎo)致的一種常見疾病，然其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但遺傳基因在鼻咽癌發(fā)病過程中可能起著重要的作用，隨著人類基因組計(jì)劃的迅速發(fā)展，NPC相關(guān)基因的定位和識(shí)別已成為研究的熱點(diǎn)。白細(xì)胞介素-18(interleukin-18，IL-18)是一種多效性細(xì)胞因子，主要由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)γ-干擾素 (interferon-γ，IFN-γ)產(chǎn)生，參與了多種疾病病理過程，在感染、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生中的作用受到廣泛關(guān)注［1-2］。近年對(duì)IL-18基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系有較多研究報(bào)道。但是，IL-18在腫瘤發(fā)生和進(jìn)程中的分子機(jī)制還尚未完全闡明。IL-18基因位于11號(hào)染色體長(zhǎng)臂上(11q22.2-q22.3)，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，分子生物學(xué)研究表明IL-18基因存在著單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)。這種基因多態(tài)性與人類多種腫瘤、霍奇金病及自身免疫性疾病的關(guān)系［3-5］已成為國(guó)內(nèi)、外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目前，有關(guān)IL-18基因多態(tài)性與NPC關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)較少文獻(xiàn)報(bào)道。為此，我們采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)的方法，研究IL-18基因多態(tài)性及單倍型與NPC的關(guān)系，為認(rèn)識(shí)NPC的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

材料和方法

一、研究對(duì)象

全部NPC來自于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院的患者，全部研究對(duì)象均經(jīng)病理證實(shí)，共190例，其中男135例，女55例，年齡(48±8)歲;選擇年齡、性別相匹配的200名無血緣關(guān)系的同期正常健康體檢者為對(duì)照組，其中男140名，女60名，年齡(47±8)歲。全部研究對(duì)象均為廣西籍人。該研究獲得右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且以上標(biāo)本采集均由本人知情同意。

二、研究方法

1.基因組DNA提取 采集靜脈血3mL，用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝;采用改良碘化鈉法提取白細(xì)胞基因組DNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.PCR擴(kuò)增 參照Genbank公布的序列(NT033899.7)設(shè)計(jì)2對(duì)引物，由上海英俊有限公司合成。(引物序列的起止位置為:-655位點(diǎn)至-519位點(diǎn))用于特異性擴(kuò)增IL-18基因包含-607位點(diǎn)的一段 DNA引物序列，上游引物為:5'-CCCTCTCCCCAAGCTTACTT-3';下游引物為:5'-TTCAGTGGAACAGGAGTCCA-3';(引物序列的起止位置為:-366位點(diǎn)至-111位點(diǎn))用于特異性擴(kuò)增IL-18基因包含-137位點(diǎn)的一段DNA引物序列，上游引物為:5'-TTGTAACATTGTAGGAATTACC-3';下游引物為:5'-ATGTAATATCACTATTTTCATGAGA-3'，IL-18的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系均為25 μL，其中含 10 ×PCR 緩沖液 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上、下游引物各 20 pmoL，模板 DNA 2.0 μL，TaqDNA 聚合酶1.25 U，不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。置熱循環(huán)儀(Bio-Rad)中94℃預(yù)變性5 min;再按下列程序循環(huán)35次，即94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸55 s;末次循環(huán)后，72℃延伸5 min。

3.擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL，分別用2 U限制性內(nèi)切酶Mse I和BfuC I(英國(guó)Biolabs公司)酶切IL-18基因-607和-137位點(diǎn)，37℃孵育3h，反應(yīng)終止后，消化片段在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，EB染色，染色后通過凝膠成像系統(tǒng)判斷結(jié)果。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS11.5軟件包進(jìn)行分析?；蛐秃偷任换蝾l率采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，研究對(duì)象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度及各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，并以比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、IL-18基因型檢測(cè)結(jié)果

IL-18基因-137 G/C多態(tài)性，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為256 bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶BfuC I酶切片段的情況，檢測(cè)到基因型有3種，CC型(256 bp 1條帶)，GC 型(256 bp，229 bp和27 bp 3條帶)，GG型(229 bp和27 bp 2條帶)，見圖 1;IL-18基因-607 C/A多態(tài)性，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為137 bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶Mse I酶切片段的情況，檢測(cè)到基因型有3種，AA型(91 bp，46 bp 2條帶)，CA 型(137 bp，91 bp和46 bp 3條帶)，CC型(137 bp 1條帶)，見圖2。為驗(yàn)證基因型結(jié)果，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果與Genbank參照序列(NT033899.7)相一致，見圖3～4。

二、NPC與對(duì)照組IL-18基因多態(tài)性的比較

IL-18基因型在2組人群中分布頻率，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，2組均達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。經(jīng)χ2檢驗(yàn)及相關(guān)分析，IL-18-137位點(diǎn)等位基因頻率在2組人群中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.895，P＜0.05);等位基因頻率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn)，C等位基因攜帶者患NPC的風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因的1.730倍(OR=1.730，95%CI:1.227～2.439);IL-18 基因-607 C/A多態(tài)性在2組人群中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

三、NPC組與對(duì)照組IL-18基因的連鎖不平衡及單倍型分析

應(yīng)用單倍型SHEsis分析軟件對(duì)IL-18基因-137 G/C和-607 C/A這2個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示IL-18基因-137 G/C與-607 C/A單核苷酸多態(tài)性存在強(qiáng)烈的連鎖不平衡(|D'|=0.951)。聯(lián)合基因型分析發(fā)現(xiàn)，3種單倍型分布頻率在NPC組與對(duì)照組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.530，P=0.009)，-137C/-607A單倍型攜帶者顯著增加了NPC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.699，95%CI:1.174～2.457)，見表2。

四、NPC多因素Logistic回歸分析

將全體研究對(duì)象作為整體進(jìn)行分析，以性別、年齡、吸煙、飲酒、IL-18基因-137 G/C和-607 C/A多態(tài)性作為自變量，建立NPC的Logistic回歸模型，見表3。經(jīng)混雜因素調(diào)整后可見，IL-18基因-137 G/C多態(tài)性是NPC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其他相關(guān)的危險(xiǎn)因素有吸煙、飲酒，與公認(rèn)的NPC危險(xiǎn)因素相符。

圖1 IL-18基因-137 G/C多態(tài)性8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖2 IL-18基因-607 C/A多態(tài)性8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

圖3 IL-18基因-137 G/C測(cè)序圖

圖4 IL-18基因-607C/A測(cè)序圖

表1 NPC組與對(duì)照組IL-18基因多態(tài)性分布頻率的比較

表2 NPC組與對(duì)照組IL-18基因單倍型分布頻率的比較

3 討 論

NPC是由環(huán)境因素和遺傳基因相互作用而導(dǎo)致的一種頭頸部惡性腫瘤。然其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但細(xì)胞因子在其中的作用越來越受到重視。IL-18是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，IL-18除能強(qiáng)烈地誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放γ-干擾素(IFN-γ)、α-干擾素(TNF-α)等細(xì)胞因子外，其亦具有增強(qiáng)FasL表達(dá)和自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞毒作用等多種生物學(xué)效能。IL-18在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及抗感染等方面有著潛在的應(yīng)用前景，并與多種腫瘤的發(fā)病可能密切相關(guān)。近年來，許多臨床研究表明IL-18基因轉(zhuǎn)染到樹突狀細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中均具有特異性和非特異性的抗腫瘤作用，認(rèn)為IL-18在腫瘤的發(fā)病和活動(dòng)性中可能起著重要的作用［6-7］。IL-18基因位于11號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。研究表明，IL-18基因具有遺傳多態(tài)性，這種基因多態(tài)性影響IL-18的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而影響到IL-18的生物學(xué)功能，從而影響到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因而，我們推測(cè)IL-18基因多態(tài)性可能與腫瘤的易患性有關(guān)。

關(guān)于IL-18基因多態(tài)性與腫瘤的關(guān)系，文獻(xiàn)報(bào)道較少。Farjadfar等［8］檢測(cè)肺癌IL-18基因多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-18基因-607 C/A多態(tài)性與肺癌的發(fā)病具有相關(guān)性，其中-607 A等位基因頻率在肺癌患者中顯著高于對(duì)照組，-607 A等位基因攜帶者明顯降低血清IL-18的表達(dá)，因而提出-607 A等位基因攜帶者機(jī)體抗腫瘤減弱，從而導(dǎo)致肺癌易感。Nong等［9］通過對(duì)NPC IL-18基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，IL-18基因-137 G/C多態(tài)性與NPC的發(fā)病具有相關(guān)性，其中-137 C等位基因可能是NPC的遺傳易感基因;聯(lián)合基因型進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，-137 C/-607 A單倍型攜帶者明顯增加了NPC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。但西班牙學(xué)者 Sáenz-López等［10］研究發(fā)現(xiàn)IL-18基因-137 G/C和-607 C/A兩位點(diǎn)多態(tài)性與腎細(xì)胞癌都具有相關(guān)性。由于基因多態(tài)性存在地域間的差異，IL-18基因多態(tài)性與NPC之間是否真正存在相關(guān)性，目前尚無定論。為進(jìn)一步明確IL-18基因多態(tài)性是否與NPC的發(fā)生相關(guān)，我們采用病例-對(duì)照的研究方法對(duì)IL-18基因多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NPC患者IL-18基因-137 G/C多態(tài)性分布與正常人比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中C等位基因攜帶者頻率在NPC組明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。本研究為排除年齡、生活習(xí)慣等混雜因素對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的干擾，采用Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)，IL-18基因-137 G/C多態(tài)性與NPC明顯相關(guān)，是NPC的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。聯(lián)合基因型進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，IL-18基因-137 G/C與-607 C/A單核苷酸多態(tài)性存在強(qiáng)烈的連鎖不平衡(|D'|=0.951)，3種單倍型分布頻率在NPC組與對(duì)照組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.530，P=0.009)，-137 C/-607 A 單倍型攜帶者明顯增加了 NPC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.699，95%CI:1.174～2.457)。結(jié)果提示，IL-18基因-137 G/C多態(tài)性和-137 C/-607 A單倍型與NPC的發(fā)病可能具有相關(guān)性，其中-137 C等位基因可能是NPC的遺傳易感基因。本研究結(jié)果與Nong等［3］報(bào)道相一致。

綜上所述，NPC是一種多因素參與的常見病，除環(huán)境因素影響之外，遺傳因素在其中也起著更為重要的作用，通過本研究可以發(fā)現(xiàn)，IL-18基因-137 G/C多態(tài)性和-137 C/-607 A單倍型與NPC的發(fā)病可能具有相關(guān)性，其中-137 C等位基因可能是NPC的遺傳易感基因。但I(xiàn)L-18基因多態(tài)性是通過何種機(jī)制對(duì)NPC產(chǎn)生影響以及在NPC發(fā)病中的確切分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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