王愛玲，紀 冰，孫萬菊，孟 瑋，安新業(yè)，宿振國，王連文，張玉梅

(1.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，山東濱州256603;2.濱州醫(yī)學院病原生物學教研室，山東煙臺264003)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresistant Staphylococcus aureus，MRSA)是一種引起醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的多重耐藥菌。1961年在英國發(fā)現(xiàn)了世界首例MRSA，從此MRSA的感染遍布全世界，并成為醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的主要病原菌。由于其耐藥譜廣、耐藥強度高，給臨床治療帶來了很大困難，也因此受到廣泛關(guān)注和重視。了解MRSA的耐藥情況，并對當前流行的MRSA臨床株進行快速、準確地分型，對于臨床合理選用藥物、了解菌株來源以及制定MRSA感染的防控措施有重要意義。我們采用多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對分離的MRSA進行基因分型及耐藥基因檢測，以了解MRSA的葡萄球菌盒染色體(SCCmec)基因型分布特征及耐藥狀況。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源及鑒定 受檢菌株均分離自濱州市某三級甲等醫(yī)院各臨床標本，共計115株;其中甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA)50 株，MRSA 65株。菌株鑒定采用先德自動化微生物鑒定儀(英國)鑒定，MRSA的篩選應(yīng)用美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的頭孢西丁紙片擴散法進行篩選。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)為本實驗室保存。

2.主要試劑與儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒、100 bp DNA Ladder Marker、PCR 試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司，溶葡萄球菌酶購自生工生物(上海)有限公司?？咕幬?青霉素、氯霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/達福普汀、萬古霉素、替考拉寧、環(huán)丙沙星、克拉霉素、克林霉素、紅霉素、加替沙星、慶大霉素、利福平 、四環(huán)素、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢曲松、氨芐西林 、復(fù)方磺胺甲口惡唑購自O(shè)XIOD公司(英國)。水解酪蛋白胨(MH)瓊脂購自杭州天和生物有限公司。

二、方法

1.金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取 參照試劑盒說明書進行。

2.SCCmec的多重PCR擴增分型 SCCmec復(fù)合擴增引物及反應(yīng)條件參考Zhang等［1］的報道并做適當改變，PCR總反應(yīng)體積為25 μL，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性45 s，65℃ 退火45 s，72℃延伸90 s，進行10個循環(huán);再94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，進行25個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳法，以100 bp Ladder DNA Marker為相對分子質(zhì)量標準，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。SCCmec Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd、V 型分別出現(xiàn) 613、398、280、776、493、200、881、325 bp 條帶，147 bp條帶為mecA基因內(nèi)部片段。SCCmec分型引物由上海英駿生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

3.藥物敏感性試驗 采用紙片擴散法測定19種抗菌藥物的敏感性，分別以金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)為質(zhì)控標準株。

4.耐藥基因的PCR擴增 對分離的65株MRSA菌株進行aac(6')/aph(2'')、aph(3')Ⅲ、tetM及ant(4')4種耐藥基因的PCR擴增，引物序列及產(chǎn)物長度參考有關(guān)文獻［2］，見表2。PCR總反應(yīng)體積為 25 μL，反應(yīng)條件為:93℃預(yù)變性2 min，93 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 個循環(huán)，最后72℃延長5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 SCCmec分型引物序列

表2 MRSA耐藥基因擴增引物序列

結(jié) 果

一、SCCmec分型

所檢測的65株MRSA SCCmec的多重PCR擴增分型結(jié)果均出現(xiàn)147 bp的mecA基因條帶，其中60株同時出現(xiàn)280 bp條帶，為SCCmecⅢ型的MRSA，4株出現(xiàn)776 bp的條帶，為SCCmecⅣa型的MRSA，1株未分型。見圖1。

二、4種耐藥基因擴增結(jié)果

aac(6')/aph(2'')基因的陽性率為93.85%，aph(3')-Ⅲ基因的陽性率為52.31%，tetM基因的陽性率為92.31%，ant(4')基因的陽性率為9.23%。見圖2。

三、藥物敏感性試驗

質(zhì)控標準菌株的各種抗菌藥物敏感性結(jié)果均在CLSI規(guī)定的范圍內(nèi)，65株MRSA對19種抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果見表3。

圖1 部分MRSA的SCCmec多重PCR分型圖譜

圖2 部分MRSA aac(6')/aph(2'')、aph(3')Ⅲ、tetM及ant(4')4種耐藥基因擴增結(jié)果

表3 65株MRSA對19種抗菌藥物的藥物敏感性結(jié)果

討 論

目前認為MRSA耐藥機制是MSSA獲得了SCCmec元件，由SCCmec元件上mecA基因編碼產(chǎn)生青霉素結(jié)合蛋白(PBP2a)，其與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的親和力低，從而產(chǎn)生對抗菌藥物的耐藥。對SCCmec進行分型的方法很多，DNA測序可以很好的詮釋SCCmec基因島的結(jié)構(gòu)，但因其操作復(fù)雜、費時費力并且價格昂貴，不適于進行臨床篩查及推廣應(yīng)用。多重PCR分型方法因其簡單快速、成本低等優(yōu)點，成為臨床大規(guī)模篩查SCCmec基因型別的重要工具。2002年，Oliveira等［3］首次報道了用多重PCR對SCCmec進行分型，2007年對原方法進行了改進［4］。但該方法是根據(jù)同時擴增出現(xiàn)的多條帶形成的譜型來判定不同的型別，對于沒經(jīng)驗的研究者來說結(jié)果解釋和判斷存在一定的困難。2005年Zhang等［1］開創(chuàng)了一種新型的多重PCR(簡稱Zhang法)，是目前公開發(fā)表的唯一的單片段多重PCR分型方法，因每個型別對應(yīng)1條特異條帶，使其對SCCmec型和亞型的檢測和分類更加簡便可行，結(jié)果更易判斷。

目前通過對SCCmec基因分型的結(jié)果研究還發(fā)現(xiàn)，MRSA來源背景不同，SCCmec基因分型結(jié)果也不相同。來自醫(yī)院感染的MRSA主要基因型別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型，很少為Ⅳ型，其耐藥特點是對多藥耐藥;而來自社區(qū)感染的MRSA菌株基因型別為Ⅳ型，耐藥特點是對非β-內(nèi)酰胺類的抗菌藥物敏感。不同類型的SCCmec不僅分布于不同環(huán)境，而且在世界不同地區(qū)流行的MRSA菌株攜帶的SCCmec類型也是不相同的。在亞洲除日本和韓國的MRSA株主要攜帶Ⅱ型SCCmec基因型外，其他國家大多數(shù)分離的MRSA株均攜帶Ⅲ型SCCmec［5］。我國的嚴雪萍、潘軍、邵冬華、張楠等［6-9］學者對各地區(qū)分離的MRSA SCCmec檢測表明，我國分離的MRSA攜帶的SCCmec基因型也以Ⅲ型為主，同時也有不同比例的其他型SCC-mec存在。本研究對所檢測的65株MRSA進行SCCmec擴增分型，結(jié)果表明60株為SCCmecⅢ型的MRSA，4株為SCCmecⅣa型的MRSA，說明引起本地區(qū)感染的MRSA以SCCmecⅢ型為主，主要為醫(yī)院獲得性感染，和國內(nèi)報道一致。

藥物敏感性結(jié)果顯示65株MRSA全部為多重耐藥株，即對3種類型以上的抗菌藥物耐藥。65株MRSA對青霉素類、頭孢菌素類全部耐藥，對慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、克林霉素耐藥率均＞90%，對氯霉素的耐藥率比較低，為4.62%。對這些菌株耐藥基因的檢測表明，本地區(qū)分離的攜帶SCCmecⅢ型MRSA的氨基糖苷類耐藥基因aac(6')/aph(2'')陽性率為93.85%，四環(huán)素類耐藥相關(guān)基因tetM的陽性率為92.31%，有著非常高的陽性率，與有關(guān)報道［10］相符，也符合醫(yī)院感染MRSA的耐藥基因攜帶特征。

MRSA已成為醫(yī)院及社區(qū)獲得性感染的主要病原菌，因其耐藥率高，由其引起的感染病死率較高，如監(jiān)測和控制不當，將引起醫(yī)院或社區(qū)感染的爆發(fā)。因此了解各地MRSA的發(fā)生率、SCCmec分型特點，進一步闡明MRSA耐藥分子機制及其基因分型，為積極開發(fā)新的抗菌藥物提供理論依據(jù)，從而切斷MRSA的傳染源和傳播途徑，預(yù)防其爆發(fā)流行。

［1］Zhang K，McClure JA，Elsayed S，et al.Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec Types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.J Clin Microbiol，2005，43(10):5026-5033.

［2］黃支密，陸亞華，陳 榆，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因及β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)基因檢測［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2005，15(2):121-123.

［3］Oliveira DC，de Lencastre H.Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.Antimicrob Agents Chemother，2002，46(7):2155-2161.

［4］Milheirico C，Oliveira DC，de Lencastre H.Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(9):3374-3377.

［5］Ko KS，Lee JY，Suh JY，et al.Distribution of major genotypes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus clonesin Asian countries［J］. JClin Microbiol，2005，43(1):421-426.

［6］嚴雪萍，陳日炳，崔海燕.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的SCCmec檢測及耐藥性分析［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2010，9(23):1771-1772.

［7］潘 軍，劉文恩，張運麗，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec基因分型及PVL基因研究［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2010，20(17):2541-2544.

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［9］張 楠，趙志軍，賈 偉，等.寧夏地區(qū)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分子流行病學研究［J］.檢驗醫(yī)學，2011，26(5):287-290.

［10］胡志東，李 金，馬 睿，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因及耐消毒劑基因的研究［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2006，16(5):481-484.