喬 蕊，張 捷

(北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100191)

抗血小板藥物在動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的血栓事件一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防中發(fā)揮著重要的作用。但是與降壓藥、降糖藥和降脂藥不同，臨床目前一般不根據(jù)抗血小板治療的效果而調(diào)整抗血小板藥物劑量。近年來，這種給予固定劑量的抗血小板藥物而不常規(guī)監(jiān)測(cè)血小板抑制程度的做法受到挑戰(zhàn)。實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果證明阿司匹林和二磷酸腺苷(ADP)受體拮抗劑(如氯吡格雷)存在廣泛的個(gè)體間差異［1-2］。前瞻性觀察研究提示阿司匹林和氯吡格雷的低反應(yīng)性與不良心血管預(yù)后有關(guān)。初步的數(shù)據(jù)提示根據(jù)血小板試驗(yàn)調(diào)整氯吡格雷劑量可以改善臨床預(yù)后［3-4］。因此重視發(fā)展安全有效的抗血小板治療的監(jiān)測(cè)手段可能將非常有意義。

一、抗血小板藥物的機(jī)制

見表1和圖1。

表1 抗血小板藥物和機(jī)制

圖1 抗血小板藥物的機(jī)制

二、血小板功能試驗(yàn)

血小板功能試驗(yàn)可以測(cè)定每個(gè)患者血小板激活達(dá)到的程度。我們主要探討在心血管疾病背景下，目前用于監(jiān)測(cè)抗血小板治療和預(yù)測(cè)血栓形成及出血的血小板功能試驗(yàn)。

(一)血小板功能試驗(yàn)

1.血小板聚集儀 血小板聚集儀的重復(fù)性受到很多因素的影響，包括采集試管內(nèi)檸檬酸鈉濃度、血小板計(jì)數(shù)的調(diào)整情況、樣本保存時(shí)間、攪拌珠速率、溫度及血樣本的pH值等。比濁法血小板聚集測(cè)定是目前實(shí)驗(yàn)室測(cè)定血小板功能廣泛使用的方法。該方法需要制備富含血小板的血漿(乏血小板血漿作為對(duì)照)，需要使用ADP、腎上腺素、膠原、花生四烯酸和瑞斯托霉素等引發(fā)聚集反應(yīng)。該試驗(yàn)通過測(cè)定加入誘導(dǎo)劑后，以整聯(lián)蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依賴的血小板聚集引起的透射光變化來反應(yīng)血小板的功能。優(yōu)點(diǎn):雖然方法設(shè)計(jì)之初是用于血小板功能缺陷檢測(cè)而不是用于預(yù)測(cè)血栓形成，但是仍是傳統(tǒng)的測(cè)定血小板功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。缺點(diǎn):制備富含血小板血漿需要離心，可能導(dǎo)致血小板提前激活。電阻法血小板聚集測(cè)定被推薦作為比濁法的備選方法。該方法使用全血樣本測(cè)定，同樣以整聯(lián)蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依賴的血小板聚集形成為檢測(cè)基礎(chǔ)。優(yōu)點(diǎn):不需要制備富含血小板的血漿，使用全血檢測(cè)，更具有生理學(xué)優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn):檢測(cè)耗時(shí)長，費(fèi)用高，通量低，不適合大量樣本檢測(cè)。

2.流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)雖然一般不進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，但其可增強(qiáng)檢測(cè)止血潛能和血小板抑制治療反應(yīng)的診斷能力。流式細(xì)胞術(shù)使用全血樣本進(jìn)行檢測(cè)，而且必須迅速檢測(cè)以保持全血的“生理”環(huán)境。血小板表面的P選擇素、活化的整聯(lián)蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)和白細(xì)胞-血小板聚集體可通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定［6］。整聯(lián)蛋白αⅡbβ3一般以靜息構(gòu)象在血小板表面表達(dá)。隨著血小板激活，其構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，只有特異性的單克隆抗體血小板相關(guān)補(bǔ)體-1(PAC-1)可以與這種激活構(gòu)象結(jié)合。因此，PAC-1陰性的血小板是靜息狀態(tài)的血小板，PAC-1陽性的血小板是活化的血小板。血小板被激活后發(fā)生脫顆粒，同時(shí)P選擇素(一般表達(dá)于α顆粒膜表面)外化表達(dá)在血小板的表面［7-8］。因此，P選擇素陰性的血小板是靜息狀態(tài)的血小板，P選擇素陽性的血小板是活化的血小板。而且P選擇素陽性的血小板可以迅速的與白細(xì)胞表面的P選擇素糖蛋白(glycoprotein，GP)配體結(jié)合形成白細(xì)胞-血小板聚集體。循環(huán)中的白細(xì)胞-血小板聚集體(特別是單核細(xì)胞-血小板聚集體)是比循環(huán)中P選擇素陽性的血小板更敏感的體內(nèi)血小板活化的標(biāo)志物。優(yōu)點(diǎn):采用全血測(cè)定，需要的樣本量很少?？稍跇?biāo)本固定后運(yùn)往中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，適用于多中心的臨床試驗(yàn)［7］。缺點(diǎn):檢測(cè)前樣本前處理復(fù)雜，設(shè)備(流式細(xì)胞儀)昂貴，對(duì)檢測(cè)技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)要求高。因此，這種方法目前主要用于科研研究?；罨嫜芰椎鞍?VASP)的磷酸化可通過商品化的試劑盒(BIOCytes，Marseilles，F(xiàn)rance)檢測(cè)［6］。這是一個(gè)對(duì)P2Y12拮抗劑作用特異的血小板功能檢測(cè)方法。如圖2所示，前列腺素E1與其血小板表面的磷酸肌醇受體結(jié)合，信號(hào)通過激活性G蛋白和AC將ATP轉(zhuǎn)化成環(huán)磷酸單腺苷，然后通過蛋白激酶A將VASP轉(zhuǎn)化成磷酸化的 VASP(VASP-P)［9］。VASPP調(diào)節(jié)GPⅡb/Ⅲa受體的活化。ADP與血小板表面的P2Y12受體結(jié)合，信號(hào)通過抑制性G蛋白抑制前列腺素E1誘導(dǎo)的AC信號(hào)的傳遞。P2Y12拮抗劑(例如氯吡格雷的活化代謝產(chǎn)物)能抑制這種ADP誘導(dǎo)的效應(yīng)。因此，當(dāng)前列腺素E1和ADP同時(shí)存在時(shí)，VASP-P與P2Y12拮抗的程度成比例。VASPP可使用透膜技術(shù)和對(duì)VASP-P特異的單克隆抗體進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)點(diǎn):VASP試驗(yàn)以 P2Y12為特異靶目標(biāo)，采用全血測(cè)定，所需樣本量少。而且，檸檬酸抗凝的全血樣本可以在室溫條件下，運(yùn)送至中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，非常適用與多中心的臨床試驗(yàn)研究。缺點(diǎn):樣本制備復(fù)雜，設(shè)備(流式細(xì)胞儀)昂貴，測(cè)定技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)要求高。

3.血栓彈力圖(TEG)TEG發(fā)明已有50多年，但是近年來才更新改造成TEG血小板圖記系統(tǒng) (TEG platelet mapping system，Haemoscope，Niles，IL)［10］。該試驗(yàn)測(cè)定血栓形成和溶解的動(dòng)力學(xué)特性，定量測(cè)定ADP或花生四烯酸激活的血小板聚集對(duì)血凝塊形成的作用。優(yōu)點(diǎn):除采用全血測(cè)定外，主要優(yōu)點(diǎn)是在測(cè)定血小板功能的同時(shí)，可以特異的測(cè)定血小板對(duì)凝血塊形成的貢獻(xiàn)。缺點(diǎn):需要樣本前處理，檢測(cè)時(shí)間長，結(jié)果解釋需要專業(yè)人士，有關(guān)研究有限。

4.血栓烷測(cè)定 血栓烷A2在血小板激活的過程中釋放，并且很快代謝成穩(wěn)定的血栓烷B2，血栓烷B2可在血清或血漿中被檢測(cè)到。優(yōu)點(diǎn):測(cè)定血栓烷B2旨在測(cè)定阿司匹林抑制COX-1的效應(yīng)。缺點(diǎn):測(cè)定血清/血漿中的血栓烷B2并不是直接的測(cè)定血小板的試驗(yàn)，因此特異性差。尿11脫氫血栓烷B2是血栓烷A2在尿液中穩(wěn)定的代謝形式，可被檢測(cè)到。優(yōu)點(diǎn):測(cè)定尿液中的11脫氫血栓烷B2旨在測(cè)定阿斯匹林抑制COX-1的效應(yīng)。缺點(diǎn):不是直接的測(cè)定血小板的試驗(yàn)，特異性差。腎功能對(duì)該試驗(yàn)有影響。

圖2 VASP-P試驗(yàn)特異檢測(cè)P2Y12拮抗劑的抗血小板作用

(二)即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)和儀器

POCT由于具有很多潛在的優(yōu)點(diǎn)，因此越來越得到臨床的重視。首先，POCT可以快速、可靠地評(píng)估止血潛能和治療反應(yīng);其次，僅需簡單的培訓(xùn)、試劑處理、定標(biāo)和一定的空間即可進(jìn)行檢測(cè);第三，這些新興的技術(shù)可能將成為凝血和血小板試驗(yàn)有力的補(bǔ)充，可用于家中、流動(dòng)門診、急診、血管成形術(shù)中心、冠心病監(jiān)護(hù)病房和手術(shù)室的監(jiān)測(cè)管理。目前臨床可供使用的檢測(cè)血小板功能的POCT試驗(yàn)見表2。

1.VerifyNow VerifyNow(accumetrics，san diego，CA)以整聯(lián)蛋白 αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依賴的血小板聚集為基礎(chǔ)［11］，是一種完全自動(dòng)化的POCT。其試劑倉包含血小板激活劑和纖維蛋白原包被的珠子(血小板的聚集可以通過纖維蛋白原包被的的珠子被放大)。全血樣本直接裝載檢測(cè)，血小板的激活通過透光率來監(jiān)測(cè)。

2.Plateletworks Plateletworks(helena laboratories，beaumont，TX)也以整聯(lián)蛋白 αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依賴的血小板聚集為基礎(chǔ)。在枸櫞酸抗凝的血液中加入ADP或者膠原，誘導(dǎo)血小板聚集，然后測(cè)定血小板計(jì)數(shù)，通過與乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的對(duì)照管中的血小板計(jì)數(shù)比較，來反應(yīng)血小板的活化能力［10］。

3.Impact cone and Platelet analyzer Impact cone and Platelet analyzer(DiaMed，Cressier，Switzerland)以剪切力誘導(dǎo)的血小板黏附聚集為終點(diǎn)。該試驗(yàn)通過在高剪切力(1 800 s-1)條件下，監(jiān)測(cè)血小板黏附聚集在一種塑料盤上的能力，來反應(yīng)血小板的功能。剪切力對(duì)于血小板的功能非常重要［12］，特別是在冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)中。Impact analyzer可以調(diào)節(jié)剪切力，與CAD中的剪切力相關(guān)。

4.血小板功能分析儀-100(PFA-100)PFA-100是在高剪切壓力條件下模擬初期止血的試驗(yàn)。依靠毛細(xì)管虹吸作用，檸檬酸鹽抗凝的全血通過膠原和腎上腺素或膠原和二磷酸腺苷包被的一個(gè)膜，膜上的孔隙在血小板黏附聚集后會(huì)被堵塞，試驗(yàn)結(jié)果即為孔隙的被封閉時(shí)間。

三、監(jiān)測(cè)抗血小板治療的方法

(一)監(jiān)測(cè)阿司匹林治療

檢測(cè)血小板功能的試驗(yàn)眾多，何種方法適用于阿司匹林抗血小板治療的監(jiān)測(cè)呢?見表3。

表2 檢測(cè)血小板功能的POCT試驗(yàn)

表3 可用于監(jiān)測(cè)阿司匹林治療的試驗(yàn)［14］

1.血清/血漿血栓烷B2和尿11脫氫血栓烷B2可被用于終點(diǎn)檢測(cè)。阿司匹林特異性的抑制血小板的COX-1，因而抑制血栓烷的產(chǎn)生。但是所有服用阿司匹林的患者都會(huì)被檢為COX-1被抑制，因此這2個(gè)試驗(yàn)缺乏臨床特異性。

2.花生四烯酸被用作激活劑。花生四烯酸可以特異的誘導(dǎo)傳遞至COX-1(阿司匹林的抑制位點(diǎn))的信號(hào)通路。但是阿司匹林抑制血小板的效應(yīng)可能并不全因抑制COX-1導(dǎo)致［13］。以花生四烯酸作為誘導(dǎo)劑，許多試驗(yàn)可被選擇用于阿司匹林抗血小板治療的監(jiān)測(cè)。見表3。

3.PFA-100已被廣泛的用于研究阿司匹林抑制血小板的反應(yīng)性。但是與前2種方法不同，PFA-100不是COX-1特異的。

(二)監(jiān)測(cè)氯吡格雷的血小板功能試驗(yàn)

有2類，見表4。

表4 監(jiān)測(cè)氯吡格雷抗血小板作用的血小板功能試驗(yàn)［14］

1.VASP-P試驗(yàn) 只有VASP-P試驗(yàn)對(duì)P2Y12受體信號(hào)通路特異。

2.ADP作為誘導(dǎo)劑的血小板功能試驗(yàn) 需要注意ADP既與P2Y1受體結(jié)合也與P2Y12受體結(jié)合，而氯吡格雷的代謝活性物只與P2Y12受體結(jié)合。因此ADP誘導(dǎo)的血小板反應(yīng)，既包括氯吡格雷抑制 P2Y12受體的效應(yīng)，還包括 ADP激活P2Y1受體的效應(yīng)。

(三)監(jiān)測(cè)GPⅡb/Ⅲa拮抗劑的血小板功能試驗(yàn)

有2類試驗(yàn)。第一類，GPⅡb/Ⅲa拮抗劑阻滯了血小板聚集的最后共同通路，可通過很多血小板功能試驗(yàn)監(jiān)測(cè)，見表5。第二類，沒有整聯(lián)蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)的構(gòu)象變化，血小板聚集就無法發(fā)生。因此采用流式細(xì)胞儀通過單克隆抗體PAC-1或配體誘導(dǎo)的結(jié)合位點(diǎn)測(cè)定血小板表面活化的GPⅡb/Ⅱa受體的變化也可以起到監(jiān)測(cè)作用。

表5 監(jiān)測(cè)GPⅡb/Ⅲa拮抗劑抗血小板作用的血小板功能試驗(yàn)

(四)需要監(jiān)測(cè)血小板功能的情況

在以下情況下可能需要監(jiān)測(cè)血小板功能，見表6。

表6 臨床中可能需要監(jiān)測(cè)血小板功能的情況

(五)理想血小板功能抑制水平

由于血小板檢測(cè)的是血小板的功能，而不是單一的物質(zhì)，所以血小板功能的檢測(cè)方法不可避免的存在很大的變異。加之不同檢測(cè)方法的原理差異，檢測(cè)結(jié)果的單位也完全不同。所以不同方法之間的可比性仍是一個(gè)很大的問題。針對(duì)理想血小板抑制水平的研究，除了方法變異大的局限性外，仍缺乏大規(guī)模的前瞻性研究，而且不同研究之間的結(jié)果差異也較大［15-16］。目前不同實(shí)驗(yàn)室使用理想血小板功能抑制水平大都是基于本實(shí)驗(yàn)室的方法和服務(wù)人群的基礎(chǔ)上建立的。

四、小結(jié)與展望

由于血小板在動(dòng)脈血栓形成起始步驟中的作用已被認(rèn)識(shí)，所以在心血管事件一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防中血小板成為主要的抑制目標(biāo)。傳統(tǒng)上，血小板活性測(cè)定一直被認(rèn)為是一種診斷工具，用來評(píng)估出血性患者。然而，更快捷的、能迅速測(cè)定血小板性能的技術(shù)也為血栓形成前狀態(tài)的決策治療創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。但是由于缺乏充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，依據(jù)血小板功能檢測(cè)結(jié)果調(diào)整抗血小板藥物劑量的指南和臨床預(yù)后仍處于缺乏狀態(tài)。

［1］Angiolillo DJ.Variability in responsiveness to oral antiplatelet therapy［J］.Am J Cardiol，2009，103(3Suppl):27A-34A.

［2］Wang TH，Bhatt DL，Topol EJ.Aspirin and clopidogrel resistance:an emerging clinical entity［J］.Eur Heart J，2006，27(6):647-654.

［3］Snoep JD，Hovens MM，Eikenboom JC，et al.Association of laboratory-defined aspirin resistance with a higher risk of recurrent cardiovascular events:a systematic review and meta-analysis［J］.Arch Intern Med，2007，167(15):1593-1599.

［4］Sofi F，Marcucci R，Gori AM，et al.Residual platelet reactivity on aspirin therapy and recurrent cardiovascular events-a meta-analysis［J］.Int J Cardiol，2008，128(2):166-171.

［5］Frelinger AL 3rd，F(xiàn)urman MI，Linden MD，et al.Residual arachidonic acid-induced platelet activation via an adenosine diphosphate-dependent but cyclooxygenase-1-and cyclooxygenase-2-independent pathway:a 700-patient study of aspirin resistance［J］.Circulation，2006，113(25):2888-2896.

［6］Michelson AD，Linden MD，Barnard MR，et al.Flow cytometry［M］.2nd ed.SanDiego:Elsevier/Academic Press，2007:545-564.

［7］McEver RP.P-Selectin/PSGL-1 and other interactions between platelets，leukocytes，and endothelium［M］.2nd ed.San Diego:Elsevier/Academic Press，2007:231-249.

［8］饒 繪，趙 惠，李 彬，等.PCI術(shù)前測(cè)定血小板表面 P-選擇素的意義［J］. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(1):12-14.

［9］Cattaneo M.The platelet P2 receptors.In:Michelson AD，ed.Platelets［M］.2nd ed.San Diego:Elsevier/Academic Press，2007:201-220.

［10］Harrison P，Keeling D.Clinical tests of platelet function［M］.2nd ed.San Diego:Elsevier/Academic Press，2007:445-474.

［11］Steinhubl SR.The VerifyNow system［M］.2nd ed.San Diego:Elsevier/Academic Press，2007:509-518.

［12］Savage B，Ruggeri ZM.Platelet thrombus formation in flowing blood［M］.2nd ed.San Diego:Elsevier/Academic Press，2007:359-376.

［13］Gurbel PA，Bliden KP，DiChiara J，et al.Evaluation of dose-related effects of aspirin on platelet function:results from the aspirin-induced platelet effect(ASPECT)study［J］.Circulation，2007，115(25):3156-3164.

［14］Michelson AD，F(xiàn)relinger AL，F(xiàn)urman MI.Resistance to antiplatelet drugs. ［J］.Eur Heart J，2006，8(Suppl G):G53-G58.

［15］Gurbel PA，Tantry US.Aspirin and clopidogrel resistance:consideration and management［J］.J Interv Cardiol，2006，19(5):439-448.

［16］Gum PA，Kottke-Marchant K，Poggio ED，et al.Profile and prevalence of aspirin resistance in patients with cardiovascular disease［J］.Am J Cardiol，2001，88(3):230-235.