邢奮麗 鄧毅 王林娥 曹克利

即早基因c-Jun是絲裂素活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導通路(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的重要成分，與神經(jīng)元凋亡過程密切相關(guān)，負責凋亡早期觸發(fā)階段的信號放大及傳遞，其表達可導致神經(jīng)元死亡[1]。c-Jun在機體其他組織的表達已有報道[2，3]，但c-Jun在豚鼠耳蝸細胞損傷中的研究尚不多見。為此，本實驗給豚鼠腹腔注射順鉑，以制備感音神經(jīng)性聾的動物模型，用免疫組織化學染色方法，觀察c-Jun在正常豚鼠耳蝸細胞的表達及耳蝸細胞凋亡時發(fā)生的改變，初步探討c-Jun在耳蝸細胞凋亡中的意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物和分組 選健康白毛紅目豚鼠20只，體重250～350 g，雌雄不限，耳廓反射靈敏，無中耳炎，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，于北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物中心潔凈飼養(yǎng)。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機分為實驗組和對照組，每組10只。實驗組腹腔注射順鉑4 mg·kg-1·d-1，連續(xù)4天，每天測體重以調(diào)整藥量。對照組每天腹腔注射等量生理鹽水。在給藥4天后24小時內(nèi)處死動物，每組均取動物的左側(cè)耳蝸制作石蠟切片，余備他用。

1.2實驗儀器和試劑 本實驗主要儀器有：GSI Audera 聽覺腦干誘發(fā)電位測試系統(tǒng)；GSI TIP50插入式耳機；手術(shù)顯微鏡(云南光學儀器廠)；Olympus 光學顯微鏡。主要試劑：注射用順鉑粉劑(10 mg/支，齊魯制藥廠)10 ml生理鹽水溶解，配成1 mg/ml溶液；10%水合氯醛；細胞凋亡檢測試劑盒(POD,武漢博士德生物有限公司 MK 1020)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB,中山公司)；一抗為c-Jun(H-79)兔多克隆抗體IgG(sc-1694)；二抗為羊抗兔抗體Envision(Dako 基因公司,即用型)。

1.3實驗方法

1.3.1ABR檢測 所有動物在最后一次給藥后24 h內(nèi)測試聽性腦干反應(yīng)，具體步驟：將動物置隔聲電屏蔽室內(nèi)，10%水合氯醛3～4 ml/kg腹腔注射麻醉滿意后，將針形記錄電極置豚鼠顱頂正中皮下，參考電極置同側(cè)乳突區(qū)，鼻尖接地，使針形電極和皮膚之間的電阻<5 kΩ；GSI TIP50型插入式耳機給聲，用100 μs、極性交替的短聲(click)作刺激聲，刺激重復率11.1次/秒，濾波范圍150～3 000 Hz，掃描時間10 ms，疊加253次；聲刺激強度自110 dB SPL開始，按10 dB一檔下降，接近反應(yīng)閾時，每次減少5 dB,以能引出可重復的波I的最小刺激聲強度為反應(yīng)閾。到反應(yīng)閾時，每耳測3次，取均數(shù)作為反應(yīng)閾值，比較每組動物給藥前后ABR反應(yīng)閾值、閾移變化。

1.3.2電鏡標本制備 將動物全麻下斷頭處死取出聽泡，2.5%戊二醛灌流固定，1%鋨酸后固定，常規(guī)制備掃描標本，日本電子SEM-6000F型掃描電鏡觀察樣品；另外，常規(guī)制備透射電鏡標本，超薄切片，厚度約60 nm，日本電子JEM-1010透射電鏡觀察。

1.3.3石蠟切片制作及HE染色 取出左耳聽泡，于手術(shù)顯微鏡下打開，常規(guī)切片，厚度為5～6 μm，玻片用多聚賴氨酸處理。取中軸切片，每隔5張選一張，每個標本選2張進行凋亡細胞檢測，2張做c-Jun蛋白染色，余下的切片每組動物中每個指標各選2張做陰性對照。組織切片HE染色，證實為完整的耳蝸組織，光鏡下觀察。

1.3.4原位檢測凋亡細胞及TUNEL陽性細胞半定量分析 用細胞凋亡檢測試劑盒，采用原位染色TUNEL法檢測凋亡細胞，操作參考試劑盒推薦方法稍加改動。結(jié)果在顯微鏡下觀察，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞，于200倍光鏡下觀察分析每張切片底回蝸軸兩側(cè)Corti器細胞，用北航數(shù)碼醫(yī)學圖像處理軟件，單點分割圖像，記錄陽性細胞總數(shù)。

1.3.5c-Jun蛋白免疫組化染色(二步法)及結(jié)果判定 石蠟切片，二甲苯脫蠟，3%過氧化氫室溫孵育；下行梯度酒精水化至水；PBS沖洗；抗原修復；滴加適當比例稀釋的一抗(預(yù)實驗選定一抗稀釋度為c-Jun 1:300)，室溫孵育，PBS沖洗；滴加二抗：羊抗兔Envision，PBS沖洗；DAB顯色，顯微鏡控制；蘇木素復染；鹽酸酒精分化；氨水返蘭；上行梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細胞內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽性細胞。用北航數(shù)碼醫(yī)學圖像分析軟件，單點分割圖像，體視學分析，每張切片用平均光密度值(mean optical density，MOD)代表該切片的染色強度，于200倍光鏡下對每張切片底回蝸軸兩側(cè)Corti器細胞進行分析，每個標本選兩張切片，取其平均值作為該標本的染色強度。

1.4統(tǒng)計學方法 使用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析，對各組動物給藥前后ABR閾值差進行成組設(shè)計t檢驗；對TUNEL標記陽性細胞記數(shù)結(jié)果用成組設(shè)計兩樣本比較的秩和檢驗(Mann-Whitney U test)；兩組動物細胞內(nèi)c-Jun蛋白表達的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1實驗組和對照組ABR反應(yīng)閾 實驗組動物給藥前后ABR反應(yīng)閾分別為37.75±5.50和54.25±9.07 dB SPL(t=6.628,P<0.05)，對照組動物給藥前后ABR閾值分別為37.00±6.16和39.50±4.26 dB SPL(t=1.602,P>0.05)，實驗組ABR閾移為16.00±10.71 dB，對照組ABR閾移為1.75±6.12 dB，兩組閾移比較差異有統(tǒng)計學意義(t=5.164,P<0.05)，說明實驗組豚鼠發(fā)生了感音神經(jīng)性聾。

2.2電鏡觀察結(jié)果 掃描電鏡見實驗組耳蝸毛細胞散亂、倒伏，毛細胞纖毛周圍滲出物形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而對照組毛細胞纖毛周圍無網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包繞附著；透射電鏡見實驗組毛細胞呈現(xiàn)出凋亡改變，表現(xiàn)為核內(nèi)染色質(zhì)邊聚，對照組細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，沒有明顯凋亡變化(圖1、2)。

2.3HE染色觀察結(jié)果 與對照組相比，實驗組Corti器細胞數(shù)目減少，排列散亂，細胞體積變小(圖3)。

2.4原位染色檢測結(jié)果 實驗組Corti器細胞數(shù)目減少，排列散亂，細胞體積變小，同時可見明顯的凋亡陽性細胞，對照組凋亡細胞染色幾乎均為陰性，只在個別支持細胞有弱陽性，陰性對照片細胞均未著色。統(tǒng)計結(jié)果：實驗組10例耳蝸Corti器的TUNEL陽性細胞數(shù)分別為1.0、2.0、1.5、1.0、2.5、0.5、3.0、0.0、3.5、4.0，對照組Corti器的TUNEL陽性細胞數(shù)分別為0.5、0.0、1.0、0.0、0.75、0.0、0.5、0.25、0.0和0.0，經(jīng)秩和檢驗，兩組Corti器TUNEL陽性細胞數(shù)相比，差異有統(tǒng)計學意義(Z為-2.959，P<0.05)(圖4)。

2.5c-Jun蛋白表達檢測結(jié)果 對照組中，c-Jun蛋白在內(nèi)耳廣泛分布，包括螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和Corti器細胞，蝸軸神經(jīng)未見表達，Corti器中部分支持細胞也有表達，染色較淺；實驗組中，Corti器細胞c-Jun染色明顯增強，以胞核明顯，同時細胞體積變小(圖5)。實驗組和對照組Corti器細胞c-Jun的MOD值分別為0.51±0.08和0.33±0.07，實驗組耳蝸細胞c-Jun表達明顯增強(t=5.359，P<0.05)。

圖1兩組豚鼠耳蝸掃描電鏡圖a 對照組耳蝸毛細胞纖毛周圍無滲出(掃描電鏡×850),b 實驗組毛細胞纖毛周圍有滲出，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(掃描電鏡×550)

圖2兩組豚鼠耳蝸透射電鏡圖a 對照組毛細胞形態(tài)正常，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻,b 實驗組毛細胞體積變小，核膜皺縮，染色質(zhì)邊聚(透射電鏡×5 000)

圖3兩組豚鼠耳蝸HE染色圖a 對照組耳蝸Corti器細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊,b 實驗組Corti器細胞，數(shù)目減少，排列散亂(HE×400)

圖4原位染色結(jié)果a 對照組耳蝸Corti器細胞TUNEL染色，毛細胞和支持細胞均為陰性,b 實驗組Corti器細胞TUNEL染色，外毛細胞和部分支持細胞核顯棕色，為陽性細胞(×200)

圖5 c-Jun蛋白表達免疫組化染色圖a 對照組c-Jun在Corti器內(nèi)外毛細胞染色較弱，部分支持細胞染色也表現(xiàn)為弱陽性，b 實驗組c-Jun在Corti器細胞表達增強，支持細胞和外毛細胞染色加深明顯(免疫組化染色×400)

3 討論

順鉑是常用的抗腫瘤藥，尤其對實體瘤和對一般化療不甚敏感的腫瘤療效顯著，臨床應(yīng)用十分廣泛。但其有嚴重腎功能損傷、耳毒性等不良反應(yīng)，嚴重影響患者化療期及化療后的生活質(zhì)量[4]。近年來，在順鉑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，合成了大量的順鉑類似物，但總體抗腫瘤水平都沒有超過順鉑，而且抗瘤譜窄，所以，暫不可能取代順鉑。為減小順鉑的毒副作用，順鉑的耳毒性機制一直是耳科學領(lǐng)域研究熱點之一。

多年來豚鼠一直被用于內(nèi)耳實驗，主要由于不同哺乳動物對耳毒性藥物的敏感性不同，而豚鼠對耳毒性藥物最敏感，損傷后內(nèi)耳的變化與人類損傷后相似，而且豚鼠內(nèi)耳體積大，操作容易。因此本實驗選用豚鼠，在順鉑導致豚鼠耳聾后，觀察耳蝸Corti器細胞凋亡及c-Jun在豚鼠耳蝸的表達情況。

研究發(fā)現(xiàn)，順鉑引起耳毒性主要為不可逆的感音神經(jīng)性聾[4]，臨床上聽力損失以高頻為主，雙側(cè)對稱，逐漸波及中低頻區(qū)。順鉑在內(nèi)耳淋巴中維持高濃度，首先損傷外毛細胞，其中第一排外毛細胞受損最重，而且病變從底回開始，逐漸向蝸尖發(fā)展。本實驗給豚鼠腹腔注射順鉑制備感音神經(jīng)性聾動物模型，發(fā)現(xiàn)實驗組豚鼠ABR反應(yīng)閾顯著提高，閾移明顯大于對照組，石蠟切片和電鏡掃描觀察結(jié)果顯示，順鉑導致動物耳蝸細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，耳蝸細胞中出現(xiàn)凋亡細胞。

一般情況下，細胞內(nèi)存在少量c-Jun蛋白，參與細胞的信息傳遞等生理過程，不同的生理和病理性刺激如缺血、缺氧、射線輻射、應(yīng)激等可以誘導其表達增加，c-Jun表達變化與某些疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，而且參與了應(yīng)激導致的神經(jīng)細胞的凋亡變化[5]。本實驗發(fā)現(xiàn)，正常情況下，c-Jun彌散分布在Corti器的部分毛細胞、支持細胞中，表達較弱，胞核中表達不明顯，耳蝸細胞發(fā)生凋亡時可見c-Jun蛋白表達水平明顯增高，胞核中表達尤其明顯，推測c-Jun可能參與了順鉑導致的耳蝸細胞凋亡。JNK/c-Jun途徑在內(nèi)耳研究中被認為是引起氧化應(yīng)激導致聽覺神經(jīng)元凋亡的主要因素[6，7]，結(jié)合目前研究，推測順鉑是通過增加氧化應(yīng)激產(chǎn)物如ROS、NO、Ca2+等激活JNK/c-Jun通路，使c-Jun表達增強并轉(zhuǎn)位入核所致，在細胞核內(nèi)c-Jun與自身、cfos或活化轉(zhuǎn)錄因子2(activating transcription factor-2,ATF2)等形成同源或異源二聚體，并結(jié)合到有與轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(activator protein-1,AP-1)特異結(jié)合位點的凋亡相關(guān)的下游基因DNA調(diào)節(jié)區(qū)，進而調(diào)節(jié)靶基因的表達和轉(zhuǎn)錄速度，導致細胞凋亡[8，9]，從而引起感音神經(jīng)性聾。

目前，c-Jun是絲裂素活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導通路的一個干預(yù)治療的潛在分子靶[10]，本實驗初步發(fā)現(xiàn)凋亡耳蝸細胞的c-Jun表達高于正常耳蝸，但是c-Jun在耳蝸細胞凋亡過程中的動態(tài)變化及與其他MAPK分子之間的關(guān)系需要進一步研究，以便為臨床上感音神經(jīng)性聾的防治提供實驗基礎(chǔ)。

4 參考文獻

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