李翠娥 陶澤璋 周濤 屈季寧 詹娜

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者常用的動(dòng)物衰老模型主要有自然衰老模型、SMAP系小鼠衰老模型[1]、臭氧損傷衰老模型[2]、去胸腺衰老模型[2]、D-半乳糖衰老模型等[3]，自然衰老的動(dòng)物模型比較符合人類(lèi)衰老的特點(diǎn), 但由于飼養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、成本高、個(gè)體差異較大、干擾較多,使其應(yīng)用受到一定的限制。D-半乳糖衰老模型由我國(guó)學(xué)者龔國(guó)清于1991年首次報(bào)道，他采用D-半乳糖0.12 mg/g給3月齡小鼠眼球后注射一個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)該模型鼠的一系列生理生化變化與21月齡小鼠接近，說(shuō)明該方法造成的動(dòng)物衰老模型可較好地模擬自然老化過(guò)程[3]。與其他幾種動(dòng)物衰老模型相比較，該模型造模方法簡(jiǎn)單易行、結(jié)果穩(wěn)定、價(jià)格低廉，目前已成為國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的動(dòng)物衰老模型，并得到了廣泛應(yīng)用[4～6]。在耳鼻咽喉科領(lǐng)域，D-半乳糖衰老動(dòng)物模型主要用于老年性聾方面的研究，并已取得一定的研究成果[7]，但在喉科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較少，因此，本研究擬通過(guò)觀察D-半乳糖致衰老豚鼠聲帶的老化特征，探討該模型應(yīng)用于喉科學(xué)尤其是老年嗓音研究的可行性，為研究老年嗓音的發(fā)生機(jī)制及防治奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取健康4月齡豚鼠12只，雌雄不拘，體重300～550 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為青年組(對(duì)照組)和D-半乳糖致衰老模型組(模型組)，每組6只。另選自然衰老的2年齡豚鼠6只作為老年組，體重600～900 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由四川瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)照組和老年組動(dòng)物均常規(guī)飼養(yǎng)，不作任何處理，模型組動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)的同時(shí)，頸背部皮下注射D-半乳糖致其亞急性衰老。

1.2.1D-半乳糖致衰老模型組動(dòng)物造模方法 給予模型組豚鼠頸背部皮下注射D-半乳糖(C6H1206，AID SCIENCE，中國(guó))300 mg·kg-1·d-1(40 mg/ml)，每天一次，連續(xù)注射6周，動(dòng)物每日稱(chēng)體重以調(diào)整藥量。在飼養(yǎng)過(guò)程中，仔細(xì)觀察各組豚鼠的外觀及行為學(xué)表現(xiàn)。

1.2.2喉部取材及標(biāo)本制備方法 模型組給藥6周造模成功后，三組動(dòng)物分別用10%的水合氯醛按350 mg/kg劑量腹腔注射麻醉后，斷頭處死，快速取出喉部，用4%的多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm；各組先分別取部分切片做HE染色，以確定所取為喉部組織并觀察聲帶組織的形態(tài)學(xué)變化，然后將各組每只豚鼠的喉部組織另一部分切片再分為2部分，分別用Alcian blue染色和Masson三色染色觀察透明質(zhì)酸和膠原蛋白在其喉部的表達(dá)。

1.2.3Alcian blue染色 切片脫蠟至水后，先用Alcian blue染液染10～20分鐘，稍水洗，然后用核固定染液復(fù)染5～10分鐘，稍水洗，常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固，光鏡下觀察。透明質(zhì)酸陽(yáng)性染色為藍(lán)色，藍(lán)色越深含量越高。

1.2.4Masson三色染色 切片脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素(Weigert鐵蘇木素A、B等比例混合液)染5～10分鐘，流水稍洗；1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)分鐘；麗春紅酸性品紅染色液5～10分鐘，流水稍洗；磷鉬酸溶液處理約5分鐘，不用水洗直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染5分鐘；1%冰醋酸處理約5分鐘，95%酒精脫水多次； 無(wú)水酒精脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，光鏡下觀察。陽(yáng)性染色呈藍(lán)色，藍(lán)色染色越深，膠原蛋白含量越高。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選取各組動(dòng)物聲帶部位的圖像，用Image-Pro Plus 6.0 For Window(IPP6.0)(Media Cybernetics 公司 )圖像分析軟件處理，取各圖片的平均值，數(shù)值越大表達(dá)越強(qiáng)，三組豚鼠聲帶透明質(zhì)酸和膠原蛋白的表達(dá)差異顯著性檢驗(yàn)采用多因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1豚鼠外觀及一般狀態(tài) 模型組豚鼠自造模4周起出現(xiàn)精神萎靡，倦怠嗜睡，進(jìn)食減少，皮膚松弛，行動(dòng)遲緩，自主活動(dòng)減少。造模成功后(6周)，模型組和老年組豚鼠毛色枯槁無(wú)光澤，頭頸部、背部、腹部掉毛嚴(yán)重。對(duì)照組外觀及一般狀態(tài)同實(shí)驗(yàn)前。

2.2三組豚鼠聲帶HE染色結(jié)果 老年組聲帶粘膜鱗狀上皮部分萎縮，部分上皮肥厚，上皮腳延長(zhǎng)，同時(shí)伴不全角化或完全角化，固有層腺體減少或消失；模型組聲帶粘膜鱗狀上皮部分萎縮伴角化不全，固有層腺體減少，可見(jiàn)慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肉芽組織形成；對(duì)照組聲帶組織結(jié)構(gòu)清楚，依次可見(jiàn)喉粘膜鱗狀上皮、粘膜固有層及固有層腺體、肌層等，未見(jiàn)上述老化改變(圖1)。

2.3各組豚鼠聲帶透明質(zhì)酸的表達(dá) 光鏡下見(jiàn)老年組和模型組聲帶組織中透明質(zhì)酸藍(lán)色染色較對(duì)照組明顯變淺，對(duì)照組、老年組、模型組透明質(zhì)酸表達(dá)的灰度值分別為0.798 351 、0.694 163和0.724 869，可見(jiàn)對(duì)照組的表達(dá)量明顯高于模型組和老年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組與老年組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

2.4各組豚鼠聲帶膠原蛋白的表達(dá) 老年組和模型組膠原蛋白藍(lán)色染色較對(duì)照組明顯加深，對(duì)照組、老年組、模型組膠原蛋白表達(dá)的灰度值分別為0.632 295、0.711 47和 0.768 211，可見(jiàn)其表達(dá)量依次為對(duì)照組< 老年組<模型組，三組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖1 三組豚鼠聲帶HE染色結(jié)果 a、b、c分別為對(duì)照組、老年組和模型組(HE染色×200)

圖2 三組豚鼠聲帶透明質(zhì)酸的表達(dá) a、b、c分別為對(duì)照組、老年組和模型組(Alcian blue染色×200)

圖3 三組豚鼠聲帶膠原蛋白的表達(dá) a、b、c分別為對(duì)照組、老年組和模型組(Masson三色染色×200)

3 討論

D-半乳糖是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種普通的代謝產(chǎn)物,動(dòng)物從乳糖中獲得半乳糖, 通過(guò)Leloir 通路、醛糖還原酶通路及半乳糖氧化酶通路三種途徑代謝。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)大量半乳糖堆積, 不能通過(guò)Leloir和醛糖還原酶通路及時(shí)代謝時(shí), 在半乳糖氧化酶作用下,生成醛類(lèi)和H2O2以及在反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生超氧陰離子, 這些物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝, 細(xì)胞中脂質(zhì)、蛋白和核酸產(chǎn)生的氧化應(yīng)激-自由基損傷、非酶糖基化作用等導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和功能障礙, 引起全身各器官受損、系統(tǒng)功能衰退等一系列病理變化, 最終促成衰老發(fā)生[8，9]。因此，在一定時(shí)間內(nèi)給予大劑量D-半乳糖, 可誘導(dǎo)動(dòng)物出現(xiàn)類(lèi)似自然衰老的整體早衰， 其可能機(jī)制為[9]:①氧化應(yīng)激-自由基損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)與線粒體老化；②非酶糖基化反應(yīng)；③端?？s短及端粒酶的活性下降；④免疫功能障礙。但D-半乳糖導(dǎo)致機(jī)體免疫衰老的真正原因并不十分清楚, 有待進(jìn)一步探究。

目前，利用D-半乳糖制備鼠衰老模型時(shí)，可以腹腔注射，也可以頸背部皮下注射，注射劑量為50～500 mg·kg-1·d-1，連續(xù)用藥6～8周[10]。造模完成后，通過(guò)行為學(xué)、生化、形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)等方面評(píng)價(jià)造模效果，結(jié)果都證實(shí)D-半乳糖所致動(dòng)物衰老模型確實(shí)能在一定程度上模擬動(dòng)物老化過(guò)程，但與自然衰老動(dòng)物也有一定差異，因?yàn)樽匀凰ダ鲜且粋€(gè)多因素的過(guò)程，其機(jī)制還涉及自由基-線粒體衰老學(xué)說(shuō)、褪黑素-松果體衰老學(xué)說(shuō)、羥基毒化衰老學(xué)說(shuō)、端粒學(xué)說(shuō)以及基因衰老學(xué)說(shuō)等[11,12]。

Kosztyla-Hojna等[13]研究了下咽癌而聲帶未受侵者行喉全切除術(shù)后的聲帶標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)老年人的嗓音質(zhì)量與聲帶黏膜的形態(tài)學(xué)變化有關(guān)，聲帶黏膜膠原纖維數(shù)量增加，基質(zhì)中可見(jiàn)成纖維細(xì)胞和慢性炎癥表現(xiàn)，上皮細(xì)胞空泡樣變，角化，細(xì)胞間隙增大，并有大量的血管，說(shuō)明老年嗓音患者存在聲帶水腫；而上皮層變薄，基質(zhì)透明化，炎癥浸潤(rùn)，大量膠原纖維和少量血管提示聲帶黏膜萎縮；并指出聲帶黏膜的水腫和萎縮是老年嗓音患者最常見(jiàn)的形態(tài)學(xué)變化；水腫在老年女性更多見(jiàn)，萎縮在老年男性更多見(jiàn)。本研究中三組豚鼠聲帶HE染色光鏡下可見(jiàn)，老年組和模型組聲帶粘膜鱗狀上皮部分萎縮伴角化不全，固有層腺體減少，模型組聲帶還可見(jiàn)慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而對(duì)照組未見(jiàn)這些改變，說(shuō)明老年組和模型組聲帶確實(shí)發(fā)生了老化改變。

大量研究[14～17]表明，透明質(zhì)酸和膠原蛋白在決定聲帶的生物力學(xué)性能方面有重要作用，老年聲帶中透明質(zhì)酸減少，膠原蛋白增加，改變了聲帶的粘彈性能，可能與嗓音發(fā)生年齡相關(guān)性改變有關(guān)，從而可以部分解釋老年嗓音的機(jī)制。從文中結(jié)果看，與青年豚鼠比較，D-半乳糖致衰老豚鼠喉部透明質(zhì)酸含量降低，膠原蛋白含量增加，與自然衰老豚鼠變化一致，結(jié)合模型組聲帶的組織病理改變，說(shuō)明本研究采用D-半乳糖注射制備的衰老動(dòng)物模型喉部出現(xiàn)了老化改變，其聲帶組織中透明質(zhì)酸及膠原蛋白含量的變化可能是喉部衰老的機(jī)制之一，該模型用于老年嗓音機(jī)制及防治的研究是可行的；另外，本研究結(jié)果顯示模型組聲帶組織中透明質(zhì)酸降低的程度低于老年組，膠原蛋白增加的程度高于老年組，說(shuō)明兩者老化程度有一定差異，一方面可能與兩者的衰老機(jī)制不同有關(guān)，另一方面也可能與模型組D-半乳糖注射的劑量有關(guān)。因此，為使衰老模型豚鼠喉部老化程度更接近自然老年豚鼠，D-半乳糖注射制備用于喉部衰老研究的動(dòng)物模型劑量還需進(jìn)一步探索；如何從發(fā)聲功能方面證實(shí)模型鼠的喉功能確實(shí)發(fā)生了老化改變，也是今后研究的目標(biāo)之一。

(致謝：感謝四川瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科的殷澤登教授對(duì)本實(shí)驗(yàn)的支持與幫助！)

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