黃建文 綜 述 徐月敏 校 審

生長因子在泌尿系統(tǒng)組織工程中的可控釋放策略研究進(jìn)展

黃建文 綜 述 徐月敏 校 審

外源性生長因子在泌尿系統(tǒng)組織工程研究中具有重要作用，但由于生長因子半衰期短，越來越多的研究利用各種控制釋放載體，使生長因子在體內(nèi)以恒定的速率緩慢而持續(xù)地釋放，以保證其在支架材料中的含量，從而促進(jìn)組織再生。本文就生長因子在泌尿系統(tǒng)組織工程中的控制釋放策略的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

生長因子組織工程泌尿系統(tǒng)可控釋放

目前，泌尿系統(tǒng)的修復(fù)重建仍然是臨床的難題之一，多采用自體組織移植，雖然效果尚可[1-2]，但是存在自身供區(qū)不足等問題。組織工程研究的進(jìn)展，顯示了其在泌尿系統(tǒng)修復(fù)重建中的良好的應(yīng)用前景。

以有的研究表明，將種子細(xì)胞復(fù)合支架材料或單純支架材料，用于部分膀胱或短段尿道的重建均能獲得良好效果，但在大面積膀胱和長段尿道重建中存在支架萎縮、纖維化等現(xiàn)象[3-4]。局部血供不佳是導(dǎo)致該現(xiàn)象的重要原因。構(gòu)建部位的供血不足，最終將導(dǎo)致構(gòu)建組織的壞死、纖維化，影響組織和器官的修復(fù)重建。

眾多的研究已明確了多種生長因子與血管形成相關(guān)，主要有血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維生長因子（b-FGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、血小板源性生長因子（PDGF）等。這些生長因子通過直接或間接作用，可促進(jìn)泌尿系統(tǒng)重建時(shí)的血管形成，還可促進(jìn)平滑肌的增殖和神經(jīng)的再生[5-6]。研究表明，雖然天然脫細(xì)胞生物支架材料中存在多種生長因子（如VEGF、b-FGF等），但在支架脫細(xì)胞處理過程會(huì)出現(xiàn)生長因子活性降低和數(shù)量減少，不能保證天然脫細(xì)胞支架中含有足夠數(shù)量的活性生長因子[7-8]。因此，將外源性生長因子通過各種方法植入支架材料中，促進(jìn)泌尿系組織的修復(fù)重建成為研究的重要方向。

外源性生長因子由于半衰期短、在體內(nèi)擴(kuò)散速度過快，難以在支架材料中持續(xù)保存，同時(shí)，擴(kuò)散的生長因子會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用[9-10]。因此，越來越多的研究利用各種控制釋放載體，使生長因子在體內(nèi)以一個(gè)恒定的速率緩慢、持續(xù)釋放，以保證其在支架材料中的含量，從而增加組織的再生。

1 細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）凍干、再水化作用

凍干是生物材料處理過程中一種較常用的方法，能使生物材料更易保存、消毒和轉(zhuǎn)移[11]。凍干的生物材料在應(yīng)用中應(yīng)經(jīng)過再水化處理，從而使得生長因子能更好地結(jié)合于生物材料。因?yàn)閮龈蔂顟B(tài)的生物材料更容易吸收水溶液，但再水化后其所吸收的水溶液能抑制其它水溶液的吸收和滲透[12]。由于溶液狀的生長因子往往不能獲得理想的生物活性，因此，在生長因子的治療應(yīng)用中需要一種有效的裝載系統(tǒng)，其中天然的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）就是一種比較理想的裝載體[13-14]。Kanematsu等[15]通過膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)（BAMG）與堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）再水化作用，將bFGF裝載于凍干的BAMG中，在體內(nèi)、外觀察生長因子在支架中的釋放情況。結(jié)果顯示在復(fù)合支架植入老鼠皮下的4周內(nèi)，bFGF緩慢釋放，而直接注射至皮下的bFGF在2 d后即沒有了bFGF的釋放；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與凍干處理前的BAMG相比，凍干后的BAMG釋放的bFGF更少。這表明相關(guān)生長因子最好與凍存后再次水化的支架材料進(jìn)行復(fù)合，可以盡可能減少支架結(jié)構(gòu)的破壞并能保護(hù)所復(fù)合的生長因子的活性[12]。

Kanematsu等[12]應(yīng)用再水化作用對(duì)復(fù)合生長因子HGF、VEGF、PDGF-BB、IGF-1和HB-EGF-BAMG的支架進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，所有生長因子均勻地分布在脫細(xì)胞基質(zhì)中，從而防止了局部過高的生長因子濃度所導(dǎo)致的副作用；同時(shí)各種生長因子能伴隨著生物材料的逐漸降解而持續(xù)地釋放。所以，凍干的脫細(xì)胞基質(zhì)能作為一種有效的、能提高生長因子活性的可控釋放載體，能促進(jìn)血管的再生。

2 構(gòu)建膠原結(jié)合域（CBD）-生長因子變異體

膠原具有抗原性小、生物降解性和相容性良好等優(yōu)點(diǎn)，在組織修復(fù)中得到廣泛的應(yīng)用[16]。為了提高膠原支架在組織修復(fù)中的作用，往往將外源性生長因子結(jié)合至膠原支架中[17]。但是，生長因子吸附至膠原支架中的方法無法滿足組織修復(fù)的需要，因?yàn)樯L因子快速擴(kuò)散可導(dǎo)致活性降低或喪失[18]。所以，增加生長因子與支架的吸附能力，從而保持足夠的濃度顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，7個(gè)氨基酸系列多肽（即膠原結(jié)合域）通過結(jié)合天然生長因子的N末端，能增加生長因子與膠原支架的黏附能力，從而防止生長因子的快速擴(kuò)散，并維持合適的濃度。以往的研究表明，表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子通過來源于vWF的膠原肽修飾后，其組織修復(fù)效果優(yōu)于天然的生長因子。但是這些研究僅強(qiáng)調(diào)了支架中生長因子的可控釋放，缺乏組織再生的相關(guān)研究[19-23]。

Lin等[24]將來源于膠原酶的CBD（TKKTLRT）與血小板源性生長因子（PDGF-BB）的N末端結(jié)合，組成一種膠原靶向系統(tǒng)，能特異性地結(jié)合至膠原支架中，并能保持生長因子的活性；在體內(nèi)，與天然的PDGF支架相比，CBD-PDGF支架具有更佳的促細(xì)胞化和血管再生的能力。

來源于vWF或膠原酶的CBD主要用于研究藥物的可控釋放，但經(jīng)CBD修飾的生長因子在支架中的發(fā)揮效果還不明了。Zhao等[25]將兩種來源不同的CBD引入至bFGF中。一種來源于vWF的CBD與bFGF結(jié)合（V-bFGF），另一種是來源于膠原酶的CBD與bFGF結(jié)合（C-bFGF），研究不同來源的CBD-bFGF在組織修復(fù)中的作用。結(jié)果顯示，兩種組合體都保留了生長因子的活性和結(jié)合膠原基質(zhì)的特性。兩種組合體在結(jié)合膠原基質(zhì)、促血管化和細(xì)胞化的作用方面均優(yōu)于天然的bFGF，但C-bFGF的作用優(yōu)于V-bFGF。表明CBD結(jié)合bFGF是一種能促進(jìn)傷口愈合和組織再生的靶向治療系統(tǒng)；C-bFGF賦予bFGF更高的膠原親和力，促進(jìn)細(xì)胞化和血管化的作用優(yōu)于v-bFGF。

研究認(rèn)為，CBD-生長因子/膠原系統(tǒng)在膀胱再生中可能具有促進(jìn)組織再生的作用。Chen等[26]應(yīng)用CBD-bFGF/膠原支架修復(fù)部分切除后的小鼠膀胱，并觀察修復(fù)術(shù)后膀胱組織和功能的修復(fù)情況。結(jié)果顯示，術(shù)后90 d，在支架與周圍膀胱組織的結(jié)合、支架的降解和細(xì)胞化、平滑肌再生和血管化、膀胱的順應(yīng)性等方面，CBD-FGF/膠原支架組優(yōu)于FGF/膠原支架和PBS/膠原支架組。表明CBD-FGF/膠原支架能更好地促進(jìn)膀胱的再生。膀胱的再生涉及多種生長因子，單一的生長因子不足以滿足膀胱再生的需要[27]。所以促進(jìn)膀胱再生的最佳生長因子、最佳劑量和最佳的生長因子載體系統(tǒng)需要更進(jìn)一步的研究。

3 生長因子的基因治療

由于外源性生長因子具有對(duì)熱和化學(xué)處理敏感、半衰期短、難以控制其在支架中的分布等不足[28]。將外源性的生長因子基因?qū)肽康募?xì)胞并有效表達(dá)，已引起廣泛關(guān)注。

基因治療需要合適的載體，目前研究較多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺病毒載體[28-29]。通過載體介導(dǎo)能表達(dá)生長因子蛋白的基因，并轉(zhuǎn)染至種子細(xì)胞或支架中，使基因在局部持續(xù)、穩(wěn)定、緩慢、高效表達(dá)生長因子蛋白，并且有利于生長因子濃度的精確維持，更好地調(diào)控組織的修復(fù)和再生。

為了研究VEGF基因修飾后對(duì)血管再生的作用，Lwaguro等[30]應(yīng)用VEGF基因修飾的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）改善肢體缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭械难苌伞＝Y(jié)果顯示，VEGF基因修飾過的EPC能明顯改善缺血組織的血液供應(yīng)，且達(dá)到同樣效果所需要的轉(zhuǎn)基因EPC數(shù)量較未轉(zhuǎn)基因的少30倍，提示聯(lián)合VEGF基因的EPC治療是一種更高效的促進(jìn)血管再生的治療模式。Chen等[31]將復(fù)合VEGF基因修飾EPC的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)（BAMG）用于膀胱組織的構(gòu)建，采用含VEGF基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染自體外周血EPC，種植于同種異體豬BAMG，體外培養(yǎng)3 d后回植，結(jié)果顯示BAMG對(duì)EPC無細(xì)胞毒性；組織工程膀胱的功能和組織學(xué)檢查表明膀胱組織隨時(shí)間延長逐漸再生；與對(duì)照組相比，VEGF基因-EPC/BAMG組的血管密度增加明顯。

Guan等[29]借鑒VEGF在缺血性心肌病治療中所取得的經(jīng)驗(yàn)，應(yīng)用VEGF165基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-GFP中，構(gòu)建pMSCV-VEGF165-GFP載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱尿路上皮細(xì)胞（UC）后種植于同種異體兔動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)中，研究基因治療在組織工程尿道中的應(yīng)用。結(jié)果提示，基因修飾過的UC能同時(shí)表達(dá)VEGF和GFP蛋白，且細(xì)胞分泌VEGF呈時(shí)間依賴性；與僅以GFP修飾的細(xì)胞相比，VEGF修飾的UC增加血管形成更明顯，同時(shí)形成的尿道上皮層更光滑、排列更規(guī)則，與正常尿道相似。

病毒載體具有潛在的致癌毒性和免疫原性，所以相關(guān)研究開始聚焦于非病毒載體。研究發(fā)現(xiàn)，非病毒轉(zhuǎn)基因載體能夠濃縮質(zhì)粒，被細(xì)胞內(nèi)吞并進(jìn)入細(xì)胞核，從而使質(zhì)粒表達(dá)基因產(chǎn)物[32]。林茂虎等[33-34]將VEGFl65 cDNA克隆于真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3.1(-)／VEGFl65，并轉(zhuǎn)染入分離純化的鼠膀胱平滑肌細(xì)胞內(nèi)。結(jié)果顯示，pcDNA3.1(-)/VEGF165轉(zhuǎn)染入鼠膀胱平滑肌細(xì)胞后，VEGF的表達(dá)增高，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液具有促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性。將平滑肌細(xì)胞植入小鼠體內(nèi)，并以膀胱缺損自然愈合和單純植入小腸黏膜下組織（SIS）為對(duì)照進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2周轉(zhuǎn)染VEGF組中新生毛細(xì)血管數(shù)量和VEGF受體的陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)高于單純SIS植入組。

4 納米或微米載體技術(shù)

隨著納米和微米技術(shù)在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的發(fā)展，納米和微米載體為外源性生長因子的可控釋放和活性保護(hù)提供了新的思路。該技術(shù)作為藥物的一種新型緩釋系統(tǒng)，常采用微球或微囊的形式，具有明顯的優(yōu)勢(shì)：①可以實(shí)現(xiàn)生長因子的長期釋放，可控性強(qiáng)[35-36]；②可以實(shí)現(xiàn)多種生長因子的同時(shí)或順序釋放[37-38]；③可使外源性生長因子具有長期生物活性[39]。同時(shí)，納米和微米載體無免疫源性和毒性，具備較高的轉(zhuǎn)移效率。所以，納米和微米載體技術(shù)在骨骼、軟骨、皮膚、心瓣膜、血管和神經(jīng)等組織的修復(fù)重建研究中應(yīng)用廣泛。

Geng等[39]為了實(shí)現(xiàn)VEGF的長期持續(xù)釋放，制備了一種新型的VEGF-納米微球-熱敏感性水凝膠系統(tǒng)，并將該系統(tǒng)植入BAMG內(nèi)。通過體內(nèi)、體外研究，研究者發(fā)現(xiàn)納米微球包裹的VEGF的生物活性得以保持，持續(xù)釋放時(shí)間超過60 d，未出現(xiàn)急性組織反應(yīng)、炎癥和毒性反應(yīng)。該新型生長因子釋放系統(tǒng)可能為泌尿系修復(fù)重建提供了一種前景良好的手段。

5 其它

有研究報(bào)道,生物活性因子通過來源于α2-纖溶酶抑制劑的肽段能共價(jià)結(jié)合至纖維蛋白基質(zhì)中[40]。因此，Lorentz等[41]將α2-纖溶酶抑制劑的8個(gè)氨基酸系列（α2PⅡ-8）結(jié)合胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的N末端，形成變異體α2PⅡ-8-IGF-1，在凝血酶/XⅢa調(diào)控聚合反應(yīng)時(shí)變異體共價(jià)結(jié)合在纖維蛋白基質(zhì)中，評(píng)估α2PⅡ-8修飾的IGF-1在促進(jìn)膀胱平滑肌再生中的作用。結(jié)果顯示，與天然IGF組相比，變異體α2PⅡ-8-IGF-1組更能促進(jìn)膀胱平滑肌細(xì)胞的增殖，表明α2PⅡ-8-IGF/纖維蛋白基質(zhì)能作為一種IGF的儲(chǔ)存體，延長IGF在基質(zhì)內(nèi)的儲(chǔ)存期，從而提高細(xì)胞增殖反應(yīng)，為促進(jìn)組織再生提供另一種有效選擇。

硫酸化氨基聚糖（GAG）通過與外源性生長因子的結(jié)合，可以作為生長因子在生物支架中的儲(chǔ)存體，增強(qiáng)生長因子在膀胱組織工程中的應(yīng)用[42-43]。因此，研究GAG與外源性生長因子一起加入生物支架內(nèi)，以促進(jìn)組織的再生成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

Loai等[44]應(yīng)用透明質(zhì)酸（HA）與VEGF結(jié)合至BAMG中，評(píng)估HA-VEGF-BAMG在膀胱組織工程中的作用。在促進(jìn)膀胱組織再生和血管形成方面，HA-VEGF-BAMG組優(yōu)于BAMG組和HA-BAMG組、HA-BAMG組優(yōu)于BAMG組。HA作為GAG家族中的一員，不僅能降低支架的孔隙率和炎癥反應(yīng)，而且具有高黏附性。所以，HA能作為生長因子的載體，有利于促進(jìn)生長因子在組織再生中的作用。

6 問題與展望

綜上所述，外源性生長因子通過多種方式保持其持續(xù)、緩慢地釋放，有效地促進(jìn)泌尿系組織、器官的再生和血管形成。但目前生長因子可控釋放的研究主要集中在短段尿道或部分膀胱修復(fù)重建中，尚不能保證這些可控釋放方式能滿足長段尿道或大面積膀胱缺損的組織再生需要。所以，保證生長因子釋放與組織修復(fù)的時(shí)間一致性尤為重要。同時(shí)，目前研究者主要研究單一生長因子在泌尿系組織修復(fù)重建中的作用，而正常組織再生往往需要在多種因子的相互作用下完成。所以，具有可以控制多種因子同時(shí)或順序釋放的可控性強(qiáng)的納米和微米載體技術(shù)有望成為極具前途的組織工程大面積缺損重建的重要技術(shù)。

促進(jìn)外源性生長因子持續(xù)、緩慢、高表達(dá)的基因治療手段在泌尿系組織工程修復(fù)重建中具有重要的作用，但由于基因治療本身存在一些問題，如可控性差、致腫瘤性等。所以，基因治療需要進(jìn)一步改進(jìn)。如微囊化基因治療技術(shù)就是一種新的促進(jìn)移植組織血管化和組織修復(fù)重建的手段[45]，但這方面的研究還在探索中，尚需更進(jìn)一步的研究。

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The Strategy of Controlled Release for Growth Factors in Urinary System Tissue Engineering

HUANG Jianwen,XU

Yueming.Department of Urology,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University Shool of Medicine, Shanghai 200233,China.Corresponding author:XU Yuemin(E-mail:xuyuemin@263.net).

【Summary】The exogenous growth factors play an important role in urinary system tissue engineering.However,because of the short half-life of growth factors,several release vehicles were studied to make growth factors release slowly and to keep suitable content in scaffold and improve tissue regeneration.This review covered the current research development in the strategy of controlled release of growth factors in urinary system tissue engineering.

Growth factors;Tissue engineering;Urinary system;Controlled release

Q813.1+2

B

1673－0364（2013）03－0173－04

2013年1月30日；

2013年3月16日）

200233上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科。

徐月敏（E-mail：xuyuemin@263.net）。

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.03.016