黃燕靜 應(yīng)振華 浙江省人民醫(yī)院 杭州 310014

整合素α5和α6亞基在硬皮病中的表達(dá)

黃燕靜 應(yīng)振華 浙江省人民醫(yī)院 杭州 310014

目的：觀察整合素α5和α6在硬皮病皮損區(qū)和正常人表皮中的表達(dá)情況。方法：運(yùn)用免疫熒光法檢測(cè)正常人和硬皮病患者皮膚中整合素α5和α6的表達(dá)。結(jié)果：α5亞基在正常人的表皮各層都有表達(dá)，基底層表達(dá)略增加，并且在胞膜和胞漿均有表達(dá)。硬皮病中各層均有α5亞基表達(dá)，基底層尤為明顯，但在顆粒層為胞漿胞膜表達(dá)，在棘層和基底層基本表達(dá)在胞膜。α6亞基在正常人表皮中在表皮各層，胞膜胞漿均有表達(dá)，但以顆粒層及真表皮交界處明顯。硬皮病中以棘層和真表皮交界處為主，棘層主要表達(dá)于胞膜。結(jié)論：在硬皮病皮損表皮中，整合素α5和α6亞基表達(dá)的部位和位置發(fā)生改變，從而造成細(xì)胞功能的異常。

硬皮病 整合素 免疫熒光法

硬皮病以原發(fā)性皮膚及皮下組織纖維化為特征,其發(fā)病機(jī)制主要涉及三個(gè)方面：①血管改變；②免疫系統(tǒng)活化與失衡；③成纖維細(xì)胞活化與纖維化[1]。其特征包括炎癥細(xì)胞因子和異常產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白介導(dǎo)的纖維化[2-4]、血管損傷和自身抗體[3]。目前很多研究表明，整合素家族和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)與皮膚的老化、表皮增生及損傷愈合、纖維化等相關(guān)[5-7]。纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)b）表面黏附分子整合素家族是介導(dǎo)Fb-細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）間作用的主要受體，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互黏附，并介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的雙向信號(hào)傳導(dǎo)[8]。近幾十年來國內(nèi)外對(duì)整合素的研究較多，主要表現(xiàn)在腫瘤上；在硬皮病方面，有研究認(rèn)為整合素及黏附分子與硬皮病皮膚的浸潤(rùn)和纖維化相關(guān)[9]。而有關(guān)整合素α5和α6亞基在硬皮病表皮上表達(dá)的研究較少。本研究應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)這兩種亞基在硬皮病皮損區(qū)表皮及正常人表皮中的表達(dá)情況，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 組織標(biāo)本 2010年5月—2011年12月我院門診及住院，符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1980年提出的硬皮病診斷標(biāo)準(zhǔn)的硬皮病患者10例，男3例，女7例，年齡20～65歲。另選擇12名正常人健康皮膚為對(duì)照組，其中男4名，女8名，年齡9～71歲。根據(jù)知情同意的原則，取硬皮病患者前臂伸側(cè)部位活動(dòng)性硬化的皮膚組織，正常對(duì)照組取相同部位，去掉皮下脂肪組織。

1.2 主要藥品與試劑 整合素α5、整合素α6的單克隆抗體購自SantaCruz公司。4%多聚甲醛：4克多聚甲醛溶解于100mL 0.01M PBS，60℃水浴助溶。甘油緩沖液：0.5mol/L pH8.5碳酸鹽緩沖液1份+分析純甘油9份。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液：按1:1 000用PBS稀釋，最終濃度100ng/mL。

2 實(shí)驗(yàn)方法

操作步驟如下：①將皮膚標(biāo)本置于恒溫冷凍機(jī)的冷凍頭上，加入少許OCT包埋劑，于冷室溫內(nèi)-25℃冷凍切片，厚度4μm，根據(jù)所備抗體切出相應(yīng)數(shù)量的片子；②用冷風(fēng)機(jī)將切片吹干。將切片置于盛有1%多聚甲醛液的染色缸內(nèi)4℃10min，固定10min后，用0.01mmol/LPBS洗3次，每次5min；加入預(yù)熱的10mM的枸櫞酸鈉緩沖液95℃，加熱20min；用10%小牛血清封閉37℃，1h。③分別滴加整合素α5和α6的單克隆抗體（1:100倍稀釋），室溫過夜。PBS洗3次，每次5min。④加熒光標(biāo)記的二抗避光下室溫37℃孵育2h，PBS液洗3次，每次5min；⑤加入DAPI染色液覆蓋切片，室溫放置5min，吸除染色液，用PBS緩沖液漂洗3次，每次5min；⑥用紙巾擦去組織周邊的液體，滴加緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 整合素α5表達(dá) 整合素α5在正常人的表皮各層都有表達(dá)，基底層表達(dá)略增加，并且在胞膜和胞漿均有表達(dá)。硬皮病皮膚組織中，各層均有表達(dá)，基底層尤為明顯，但在顆粒層為胞漿胞膜表達(dá)，在棘層和基底層基本表達(dá)在胞膜。見圖1（封三）。

3.2 整合素α6表達(dá) 整合素α6在正常人表皮各層，胞膜胞漿均有表達(dá)，但以顆粒層及真表皮交界處明顯。在硬皮病皮損表皮中，以棘層和真表皮交界處為主，棘層主要表達(dá)于胞膜。見圖2（封三）。

4 討論

整合素是由α（120～185kD）和β（90～110kD）兩個(gè)亞單位形成的異二聚體。目前已發(fā)現(xiàn)18種α亞單位和10種β亞單位，它們按不同的組合構(gòu)成24種整合素，α亞單位起調(diào)節(jié)作用，β亞單位則負(fù)責(zé)信號(hào)傳導(dǎo)[10]。研究表明，整合素和人的正常生理活動(dòng)、部分疾病相關(guān)，例如腫瘤、炎癥、自身免疫和血栓形成[11]。整合素以層粘連蛋白為配體，參與形成半橋粒，在保持皮膚完整性中發(fā)揮作用[12]。α5亞基能夠和Fn相連接，對(duì)血管形成和維持血管的完整性具有特殊意義，有研究指出敲除α5亞基的小鼠無法存活。因此，缺乏α5無法形成血管，α5特異性識(shí)別Fn，與之結(jié)合，可在血管新生及維持中起作用[13]。整合素α6主要與β1及β4亞單位結(jié)合，組成α6β1及α6β4，是層粘連蛋白（Laminin，LN）的單特異性受體，介導(dǎo)上皮細(xì)胞與基膜的黏附，在細(xì)胞的增殖與分化、信號(hào)傳導(dǎo)[14]。關(guān)于硬皮病的發(fā)病機(jī)制仍不明確，但研究顯示其與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白介導(dǎo)的纖維化和血管損傷密切相關(guān)[2-4]。

目前血管生成疾病有幾十種，包括惡性腫瘤、感染、免疫性疾病等等，而血管內(nèi)皮與基質(zhì)細(xì)胞黏附分子對(duì)腫瘤血管生成的作用越來越受到關(guān)注，其中包括整合素家族[15]。近幾年有關(guān)整合素與硬皮病相關(guān)性的研究較少，Iannone等[11]通過免疫熒光和流式細(xì)胞儀分析8例局限性硬皮病和5例彌漫性硬皮病的成纖維細(xì)胞，認(rèn)為與正常人相比，彌漫性硬皮病皮損中α5亞基表達(dá)顯著下降，α6亞基表達(dá)明顯上升。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，整合素α5、α6亞基在硬皮病患者表皮中表達(dá)的部位和位置上的改變可能導(dǎo)致了角質(zhì)形成細(xì)胞的功能發(fā)生變化，從而影響細(xì)胞及血管功能。本實(shí)驗(yàn)從整合素在皮膚結(jié)構(gòu)上表達(dá)的變化更進(jìn)一步說明整合素與硬皮病病變的密切相關(guān)性。

對(duì)于整合素與腫瘤之間的關(guān)系有較多的研究，包括肺癌、腸癌、乳腺癌等。研究[16]發(fā)現(xiàn)，在乳腺腫瘤中整合素α5亞基過度表達(dá)和α6亞基表達(dá)減少，且通過影響分子調(diào)控機(jī)制的表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞周期。文獻(xiàn)[17]報(bào)道，αvβ3是最引人關(guān)注的腫瘤血管新靶標(biāo)，αvβ3在腫瘤血管上選擇性地大量表達(dá)，而在正常靜止的血管不表達(dá)；αvβ3介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附；整合素可以通過胞內(nèi)區(qū)與黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）或非受體酪氨酸激酶相互作用，調(diào)節(jié)Rho A信號(hào)通路。αvβ3為靶標(biāo)的藥物已經(jīng)處于臨床Ⅰ期或Ⅱ期實(shí)驗(yàn)，用于治療結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤。

整合素家族與血管內(nèi)皮的變化緊密聯(lián)系，腫瘤及硬皮病的發(fā)病均與血管異常相關(guān)。通過整合素與腫瘤相關(guān)研究中進(jìn)行延展，整合素或?qū)⒊蔀橛财げ∩踔撩庖呦到y(tǒng)性疾病靶向治療的新方向。

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The expression of Integrin α5 and α6 altered in scleroderma

HUANG Yanjing，YING Zhenhua.Zhejiang Provincial People's Hospital，Hangzhou（310014），China

Objective：To investigate the expression of integrin α5 and α6 in scleroderma and normal epidermis.Methods：The expression of integrin α5 and α6 in normal subjects and scleroderma skins were assessed by immunofluorescence method.Results：The α5 subunit in normal skin was expressed both in all layers,slightly increased in the basal and in the membrane and cytoplasm.The expression of α5 subunit in lesions of scleroderma was evidently observed in the basal layer,and was also noted in the cytoplasmic and membrane of granular layer and in the membrane of spinous and basal layers.As for the α6 subunit,its expression in normal skin was found in all layers and in the cytoplasm and membrane,with more obvious expression in the granular layer and true epidermal junction.In Scleroderma,the expression of α6 subunit was mainly in spinous layer and true epidermal junction and in the membrane of spinous layer.Conclusion：The expression of integrin α5 and α6 subunits was altered in scleroderma epidermis,resulting in cellular dysfunction.

scleroderma integrin immunofluorescence

2013-05-22

應(yīng)振華，Tel：13706712139；E-mail：13706712139@126.com