商勇 何濤 迪拉拉·吐爾遜 沙吉旦·牙生 陳小玉

都偉欣 陳保文 徐苗 楊蕾 盧錦標 王國治

柳正衛(wèi) 黃玉 趙雁林

路希維

·論 著 ·

140例維吾爾族青壯年肺結(jié)核合并肺原性心臟病患者的臨床分析

商勇 何濤 迪拉拉·吐爾遜 沙吉旦·牙生 陳小玉

目的 分析維吾爾族青壯年肺結(jié)核合并肺原性心臟病（簡稱“肺心病”）的臨床特點和治療情況。方法對2010—2012年間新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院收治的140例年齡在20～55歲的維吾爾族青壯年肺結(jié)核合并肺心病患者的病程、臨床特點、治療情況進行回顧性分析。結(jié)果 140例患者中，咯血28例，肺部有啰音140例，肺氣腫征象68例，肝臟腫大、下肢水腫81例，胸腹腔積液45例。心電圖診斷肺心病62例，其中肺型P波者60例，肢體導聯(lián)QRS低電壓59例，心律失常51例。心臟彩色超聲診斷肺心病78例。140例患者經(jīng)過治療，好轉(zhuǎn)121例，死亡19例。結(jié)論 維吾爾族青壯年肺結(jié)核合并肺心病患者臨床癥狀不典型，需要及時發(fā)現(xiàn)和規(guī)范診治，降低死亡率。

結(jié)核，肺/并發(fā)癥； 肺心?。?青年人； 維吾爾族

慢性肺原性心臟?。ê喎Q“肺心病”）是指肺、胸部或肺部血管疾病引起的肺動脈高壓，右心室肥大，最后發(fā)展為右心衰竭的一種心臟病。其病因很多，慢性支氣管炎為最多見，肺結(jié)核次之。肺結(jié)核引起的肺心病占所有肺心病的11%～18.2%［1］，是肺結(jié)核患者主要死亡原因之一。老年肺結(jié)核患者合并肺心病已引起臨床醫(yī)師的高度重視，但青壯年肺結(jié)核患者合并的肺心病由于臨床癥狀不典型、心電圖檢查正常等往往更易被忽略，導致漏診、誤診，從而延誤心衰的治療。有資料顯示，青壯年肺結(jié)核合并肺心病占所有肺結(jié)核合并肺心病患者的20%［2］。筆者對我院2010—2012年間收治的維吾爾族青壯年肺結(jié)核合并肺心病患者的臨床特點進行回顧性分析，為該病能夠得到早期診斷和治療，及尋找預后的影響因素提供幫助。

資料和方法

一、資料來源

2010—2012年我院收治的肺結(jié)核合并肺心病住院患者693例，其中679例為維吾爾族患者（98.0%），14例為漢族患者（2.0%），對679例維吾爾族患者中的140例維吾爾族青壯年（20～55歲）患者的資料進行分析整理。140例維吾爾族青壯年患者的平均年齡為（38±6）歲，男84例，女56例，結(jié)核病病程5～8年（肺結(jié)核病程超過3年的患者114例），結(jié)核病合并肺心病病程2～4年。根據(jù)中華醫(yī)學會結(jié)核病學分會的《肺結(jié)核診斷和治療指南》的標準［1］，接受規(guī)范抗結(jié)核治療者51例，不規(guī)范治療者89例。

二、診斷標準

肺結(jié)核的診斷根據(jù)參考文獻［1］；肺心病的診斷根據(jù)參考文獻［3］。本組患者均符合以下診斷及選例標準：（1）有長期肺結(jié)核病史；（2）有心功能不全的癥狀或體征，尤其是右心衰竭體征；（3）右心室肥大或右下肺動脈橫徑＞15 mm或肺動脈段高度＞3 mm；（4）心電圖或心臟B超證實者。

三、臨床檢查

1.實驗室檢查：對所有患者進行實驗室檢查，確定血白細胞是否升高（即＞1.0×109/L），紅細胞沉降率是否加快（即＞20 mm/1 h）；痰涂片查抗酸桿菌，標本采集為痰液、超聲霧化導痰、下呼吸道采樣、支氣管沖洗液。涂片檢查采用萋-尼抗酸染色法。動脈血氣分析：采血部位為橈動脈，抽血1～1.5 ml，肝素抗凝；化驗單上注明吸氧濃度。

2.胸部X線檢查：140例患者均行胸部X線檢查。肺結(jié)核典型的X線胸片表現(xiàn)為：病變位于肺結(jié)核的好發(fā)部位，即為上葉尖后段及下葉背段，陰影形態(tài)為斑片、浸潤、結(jié)節(jié)及融合影像，病變可按肺段分布，常伴有播散及空洞。肺心病的X線胸片表現(xiàn)為肺動脈段膨出，右下肺動脈增粗（橫徑≥15 mm，或右下肺動脈橫徑與氣管橫徑比值≥1.07，或動態(tài)觀察其橫徑增寬＞2 mm）；肺動脈高壓顯著時，肺動脈可呈截斷或鼠尾狀；右心室流出道增寬時，表現(xiàn)為肺動脈圓錐部顯著突出。影像學資料由至少2名醫(yī)生閱片，差異通過共同討論最后確定診斷。

3.心電圖檢查：所有患者均常規(guī)記錄心電圖，查是否有肺型P波、右心室肥厚、重度順時針轉(zhuǎn)位，及肢體導聯(lián)QRS低電壓等。

4.心臟彩色超聲（簡稱“彩超”）檢查：對出現(xiàn)右心功能不全、呼吸衰竭及心電圖有肺型P波，肢體導聯(lián)QRS低電壓，心律失常等改變患者行心臟彩超檢查，以確定是否有右心室肥厚、肺動脈增寬。

四、治療

肺心病的治療及好轉(zhuǎn)的判定標準按照文獻［3］。結(jié)核病的治療及好轉(zhuǎn)的判定標準參照文獻［4-5］。

結(jié) 果

一、臨床分析

本組140例患者中，咯血28例，肺部有啰音140例，有肺氣腫征象68例，肝臟腫大、下肢水腫81例，胸腹腔積液45例。

實驗室檢查血白細胞及中性粒細胞升高46例；血紅細胞沉降率加快92例；查痰找抗酸桿菌陽性21例，陰性119例；動脈血氣分析Ⅱ型呼吸衰竭98例，Ⅰ型呼吸衰竭42例。

X線胸片病變超過3個肺野者102例（肺野劃分按照兩肺上中下共6個肺野劃分的方法），肺單側(cè)損壞者87例，肺雙側(cè)損壞者53例，合并結(jié)核空洞者65例，伴結(jié)核性胸膜炎或胸膜肥厚者79例，有肺大泡者87例。心電圖診斷肺心病62例，其中肺型P 波60例，肢體導聯(lián)QRS低電壓59例，心律失常51例，缺血改變42例。通過彩超診斷肺心病78例，心臟彩超檢查顯示，右室壁厚度平均為4.2 mm，肺動脈壓力平均56 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），最高可達90 mm Hg。

二、治療及預后

本組140例患者均使用左氧氟沙星（0.5 g/次，1次/d）、頭孢霉素（根據(jù)患者情況調(diào)整劑量）控制肺部感染，同時根據(jù)上述指南進行抗結(jié)核治療；使用氨茶堿解痙平喘，并給予氧氣吸入治療；其中38例患者使用強心劑地高辛（異羥基洋地黃毒苷）0.125 mg/次，1次/d，同時口服或間斷給予西地蘭（去乙酰毛花苷注射液）0.2 mg/次靜脈推注（每天1次或每天多次），利尿劑速尿（呋塞米）20～60 mg/次靜脈推注或泵入（每天1次或每天多次）。140例患者經(jīng)過上述治療病情好轉(zhuǎn)，血氣變化：PO2上升約20～30 mm Hg，PCO2下降至正常水平（＜50 mm Hg），右心功能不全改善，雙下肢水腫減退，肝臟腫大消失。同時患者自覺呼吸困難、心悸、納差明顯好轉(zhuǎn)。心臟彩超顯示肺動脈壓力下降約20 mm Hg。好轉(zhuǎn)后定期進行門診隨訪，每月隨訪1次，復查 X線胸片及心電圖。本組患者121例好轉(zhuǎn)，19例死亡。

討 論

肺結(jié)核不僅破壞肺組織，還會合并肺氣腫、肺局限性或廣泛性纖維化、胸膜增厚，使肺功能受損，導致低氧血癥，引起肺小血管收縮。上述肺部病理改變引起肺血管狹窄或受壓，使肺血管面積減少，從而造成肺動脈系統(tǒng)阻力增加，產(chǎn)生肺動脈高壓。進而發(fā)展為右心室肥厚，最終導致右心衰竭。

文獻［6］顯示：青年、壯年活動性肺結(jié)核和涂陽肺結(jié)核患病率均逐漸升高，青壯年肺結(jié)核占肺結(jié)核患者總數(shù)的70.3%；因新疆喀什地處邊疆偏遠地區(qū)，患肺結(jié)核的多為維吾爾族農(nóng)民，文化水平較低，對疾病的認識程度不夠，且受經(jīng)濟條件限制，維吾爾族青壯年患者患病率仍較高。

本組資料顯示，140例患者中肺結(jié)核病程超過3年者達114例，占總數(shù)的81.4%；受累肺野超過3個者達102例，占總數(shù)的72.9%；伴有空洞者65例，占總數(shù)的46.4%。青壯年肺結(jié)核發(fā)生肺心病主要與肺結(jié)核的病程及病灶所累及的范圍有關(guān)，病灶累及范圍越廣，發(fā)病率越高。

肺結(jié)核合并肺心病的早期診斷較困難，尤其對于青壯年患者，由于臨床癥狀不典型，更易誤診。肺結(jié)核患者的肺部組織不均勻纖維化，對周圍組織產(chǎn)生牽拉，使心臟在胸腔的解剖位置發(fā)生改變，所以部分患者的右心室肥厚和電軸右偏，不能在心電圖中表現(xiàn)出來［2］。此外，也有資料顯示，青壯年肺結(jié)核的誤診率幾乎達50%［6］。一些患者直到發(fā)生了心力衰竭后才得以確診，由此對病程較長的或病變較廣泛的患者要警惕發(fā)生肺心病的可能。本組資料顯示，78例患者心電圖不典型。故及時發(fā)現(xiàn)原發(fā)病，并給予合理有效的治療，不但可以大幅度地減少肺心病呼吸衰竭的發(fā)生，還可以從根本上杜絕結(jié)核分枝桿菌的再傳播。本組患者痰檢陽性只有21例，119例痰檢為陰性，痰檢陽性率只有15.0%，較低的原因可能是：（1）留取標本方法不正確；（2）留取標本后放置的時間過長；（3）實驗室監(jiān)測的技術(shù)水平較低。

肺結(jié)核合并肺心病關(guān)鍵在于對肺結(jié)核的及時發(fā)現(xiàn)和進行正規(guī)治療，并積極處理并發(fā)癥，防止病情反復加重和病程遷延。對于肺組織廣泛纖維化的患者，除給予必要的抗結(jié)核治療外，重點應(yīng)與防治慢性阻塞性肺疾病一樣，積極預防和治療感冒及慢性支氣管炎，減少繼發(fā)感染，從而防止肺心病的發(fā)生、發(fā)展和急性加重，降低死亡率。

［1］中華醫(yī)學會結(jié)核病學分會.肺結(jié)核診斷和治療指南.中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24（2）：70-74.

［2］董守元，祁停妹，黃漢平，等.肺結(jié)核致肺心病的心電圖漏診原因分析.中國心臟起搏與心電生理雜志，2000，14（3）：203.

［3］中華醫(yī)學會.臨床診療指南呼吸病學分冊.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：18-19.

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部疾病預防控制局，中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司，中國疾病預防控制中心.中國結(jié)核病防治規(guī)劃實施工作指南（2008年版）.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2009.

［5］肖和平.耐藥結(jié)核病化學治療指南.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

［6］全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查技術(shù)指導組，全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告.中國防癆雜志，2012，34（8）：458-507.

（本文編輯：郭萌）

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結(jié)核分枝桿菌IFN-γ體外檢測試劑的生產(chǎn)質(zhì)量控制與臨床研究探討

都偉欣 陳保文 徐苗 楊蕾 盧錦標 王國治

【摘要】依據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》等相關(guān)的法律法規(guī)，分別針對結(jié)核分枝桿菌IFN-γ（interferon gamma，γ干擾素）體外檢測試劑盒的主要原材料、生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品質(zhì)量控制，以及臨床研究的技術(shù)要求進行了概述，為該類試劑盒的研發(fā)和注冊提供技術(shù)支撐。

【關(guān)鍵詞】分枝桿菌，結(jié)核； γ干擾素釋放試驗； 試劑盒，診斷； 質(zhì)量控制

【Abstract】According to Management Method of In Vitro Diagnostic Reagents Registration（Interim）and other relevant laws and regulations，we summarize respectively the main raw materials，production process，product quality control and technical requirements of clinical study for in vitro Mycobacterium tuberculosis IFN-γdetection kits and provide technical support for the development and registration for such kits.

【Keywords】Mycobacterium tuberculosis； Interferon-gamma release tests； Reagent kits，diagnostic； Quality control

結(jié)核分枝桿菌γ干擾素（interferon gamma，IFN-γ）體外檢測試劑盒主要是通過檢測特異性IFN-γ的釋放來輔助診斷結(jié)核病或判定機體是否已經(jīng)感染結(jié)核分枝桿菌的一種體外診斷方法［1］。由于檢測方法的不同，結(jié)核分枝桿菌IFN-γ體外檢測試劑盒包含兩種類型，一種是應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）來定量檢測特異性IFN-γ的釋放水平；一種是應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點法（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）在單細胞水平定量檢測分泌IFN-γ的效應(yīng)性T細胞。盡管兩類試劑盒的檢測方法稍有差異，但其工作原理基本相似，檢測用途一致。筆者將針對兩類試劑盒的主要原材料、生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品質(zhì)量控制，以及臨床研究的技術(shù)要求進行概述，為從事結(jié)核分枝桿菌INF-γ體外檢測試劑盒人員提供參考。

原材料

一、主要生物材料

主要生物原料包括IFN-γ抗體、相關(guān)酶標記IFN-γ抗體、IFN-γ標準蛋白、結(jié)核特異性刺激物（重組抗原或合成多肽）、陽性對照刺激物（刀豆蛋白或植物血凝素）等。這類原料主要用于包被酶標反應(yīng)板、刺激特異性IFN-γ釋放、檢測IFN-γ、制備校準品（標準品）等。

主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，應(yīng)簡述其制備程序。IFN-γ抗體和相關(guān)酶標記IFN-γ抗體應(yīng)提供各級細胞庫的詳細制備過程和檢定情況，以及抗體的生產(chǎn)工藝條件等資料。相關(guān)酶標記IFN-γ抗體還需提供標記酶的來源，標記方法和酶標記抗體的質(zhì)量鑒定情況。結(jié)核重組抗原應(yīng)提供工程菌的構(gòu)建、各級種子庫的制備，生產(chǎn)工藝條件等項資料，以確保工藝相對穩(wěn)定。IFN-γ標準蛋白如為重組來源產(chǎn)品，也需提供工程菌的構(gòu)建、各級種子庫的制備，生產(chǎn)工藝條件等項資料。

結(jié)核合成多肽應(yīng)提供其合成方法、生產(chǎn)工藝條件和檢定情況等項資料。刀豆蛋白和植物血凝素一般為商購原料。

以上生物原料若購買，其供應(yīng)商要求相對固定，不能隨意變更供應(yīng)商。如生產(chǎn)工藝或供應(yīng)商等有變更，應(yīng)依據(jù)國家相關(guān)法規(guī)的要求進行變更申請。

主要生物原料的常規(guī)檢驗項目一般包括：外觀、純度、相對分子量、蛋白質(zhì)濃度、效價和功能性實驗（至少應(yīng)有陽性參考品符合率、陰性參考品符合率和最低檢出限），應(yīng)符合企業(yè)生產(chǎn)規(guī)定的要求。標記用酶若為辣根過氧化物酶，酶的純度RZ值（德文Reinheit Zahl）應(yīng)不低于3.0［2］。

二、生物輔料

生物輔料一般指在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）等。其中牛血清的檢定項目至少應(yīng)包括：外觀、無菌試驗、總蛋白含量和球蛋白含量等，BSA的檢定項目至少應(yīng)包括：外觀、溶解性、總蛋白含量、總蛋白中的BSA含量、BSA的凈含量等，質(zhì)量標準應(yīng)符合2000年版的《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準》［3］規(guī)定的標準要求。此外，這些生物輔料還應(yīng)進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品進行測定，均不能出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

三、化學原材料

化學原材料的質(zhì)量標準參照文獻［3］分析純級別進行檢驗，主要的檢測指標包括：外觀、一般鹽類檢測、溶液p H值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等。在購入時，生產(chǎn)商必須提供該批次化學原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗報告。

四、其他物料

1.酶標板或聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜板：酶標板或PVDF膜板應(yīng)進行外觀、吸附能力和精密性等的檢測。吸附能力和精密性應(yīng)采用合適的方法進行檢驗，一般用一定濃度的鼠IgG包被板條，再用一定濃度的羊抗鼠IgG-HRP與其進行反應(yīng)，通過酶標儀讀數(shù)，計算不精密性（coefficient of variation，CV），一般規(guī)定CV（%）應(yīng)不高于15%。

2.液體試劑裝量瓶：各液體試劑應(yīng)有相應(yīng)的裝量瓶，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標準，如裝量瓶的規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。一般規(guī)定裝量應(yīng)不低于標示量。

3.其他材料：包括試劑瓶標簽、黏膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應(yīng)參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》［4］和《醫(yī)療器械說明書、標簽和包裝標識管理規(guī)定》［5］建立相應(yīng)質(zhì)量控制。

主要生產(chǎn)工藝

一、半成品的制備程序

IFN-γ抗體制備通常采用IgG親和層析或其他適宜方法進行；相關(guān)酶標記IFN-γ抗體的制備通常采用常規(guī)過碘酸鈉-乙二醇法或其他適宜方法進行酶標記；重組來源的IFN-γ標準蛋白和結(jié)核特異性刺激蛋白通常應(yīng)用不同層析方法的組合來進行制備，以保證其純度能≥95%；結(jié)核特異性合成多肽通常應(yīng)用固相合成的化學方法或其他適宜方法進行制備，以保證多肽在結(jié)構(gòu)和純度方面達到質(zhì)量要求。

包被IFN-γ抗體濃度和酶標記IFN-γ抗體工作濃度的選定通常采用方陣滴定法進行；研究還應(yīng)包括對包被液及包被條件，封閉液及封閉條件，干燥條件進行優(yōu)化，以保證包被液能使IFN-γ抗體很好地與PVDF膜結(jié)合，封閉液能很好的封閉PVDF膜上多余的結(jié)合位點，干燥條件保證在工作過程中抗體不會從固相載體上脫落；其余如反應(yīng)板、陽性對照刺激物、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等要保證其穩(wěn)定性符合產(chǎn)品要求。特別應(yīng)注意的是，若以上液體組分涉及生物安全性問題，制備時應(yīng)在相應(yīng)的生物安全實驗室完成。

應(yīng)對包被抗原板按半成品質(zhì)量控制的標準進行抽樣檢定，并應(yīng)符合相應(yīng)項的規(guī)定要求。各種工作液應(yīng)有明確的配方及嚴格的配制程序，其質(zhì)量控制主要包括酶結(jié)合物的功能性實驗及穩(wěn)定性；各種溶液的外觀、p H值等；酶作用底物應(yīng)測定在無相應(yīng)酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標；終止液應(yīng)對其終止酶促反應(yīng)的能力進行測定。對于定量檢測試劑，其標準品（或校準品）溶液應(yīng)具有量值溯源性。

二、成品的分批、分裝和包裝

按照文獻［2］中《生物制品分批規(guī)程》、《生物制品分裝和凍干規(guī)程》以及《生物制品包裝規(guī)程》進行分批、分裝與凍干以及包裝。

質(zhì)量控制

一、半成品質(zhì)量控制

以企業(yè)參考品進行半成品質(zhì)量控制。ELISPOT方法檢測的試劑盒檢定項目至少應(yīng)包括陰性參考品符合率、陽性參考品符合率和精密性。ELISA方法檢測的試劑盒檢定項目除陰性參考品符合率、陽性參考品符合率和精密性檢定項目外，還應(yīng)包括線性檢測和最低檢出量檢測項目。

陰性參考品和陽性參考品至少各5份，精密性參考品至少1份。

二、成品質(zhì)量控制

（一）出廠檢驗

ELISPOT方法的成品質(zhì)量控制應(yīng)包括外觀、陰性參考品符合率、陽性參考品符合率和精密性檢測項。

ELISA方法的成品質(zhì)量控制除以上4項外，還應(yīng)包括最低檢出量、線性、準確性和穩(wěn)定性等檢測項。

兩種檢測方法，無論是應(yīng)用新鮮血樣還是凍存的細胞、凍存的培養(yǎng)上清或凍存的血漿，其陰性參考品符合率應(yīng)不低于75%，陽性參考品符合率應(yīng)不低于75%，精密性檢測項的CV值應(yīng)不低于30%。其他質(zhì)控指標可參照型式檢驗中的有關(guān)檢測項進行，或生產(chǎn)企業(yè)視質(zhì)量控制情況而定。

（二）型式檢驗

由于該類試劑檢測使用血液樣本新鮮程度影響其檢驗結(jié)果，并且目前尚無供評價用的國家參考品，在進行國家規(guī)定檢驗或抽驗時使用由第三方收集的血液樣本進行質(zhì)量評價，企業(yè)成品質(zhì)量控制技術(shù)指標應(yīng)考慮以下幾點要求。

Ⅰ.檢驗用樣本的基本要求

（1）應(yīng)根據(jù)該試劑使用說明確定樣本的采集量與采集用容器。精密性檢測用參考品如需使用新鮮血液，建議其采集數(shù)量大于注冊標準中的規(guī)定數(shù)量。（2）陽性參考品中菌陽參考品宜采用1個月內(nèi)確診的痰涂片陽性和（或）培養(yǎng)陽性的結(jié)核病患者的血樣；菌陰參考品采用1個月內(nèi)痰涂片陰性和（或）培養(yǎng)陰性的臨床疑似結(jié)核病患者的血樣，如在隨后的最終診斷為非結(jié)核病患者，則應(yīng)給予剔除。由于陽性參考品存在被剔除的可能性，建議其采集數(shù)量大于注冊標準中的規(guī)定數(shù)量。（3）陰性參考品應(yīng)依照隨機原則采集無結(jié)核病臨床癥狀的健康志愿者的外周靜脈血，采血后立即進行TB-PPD皮試或鑒別診斷用超敏反應(yīng)原的同體雙臂皮膚試驗，24～72 h后觀察并記錄結(jié)果。（4）送檢廠家負責運輸參考品血樣，建議在采血后的2 h內(nèi)，最長不超過6 h送至中國食品藥品檢定研究院承檢科室。同時附送樣品來源的詳細資料，應(yīng)包括陽性參考品的涂片和（或）培養(yǎng)的檢測結(jié)果，應(yīng)提供分裝規(guī)格和分裝數(shù)量的數(shù)據(jù)。

Ⅱ.檢測項目

1.物理檢查：應(yīng)對試劑盒外觀、試劑盒中各液體組分（如陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物液、終止液等）以及酶標板或PVDF板外觀等進行檢查，應(yīng)符合相應(yīng)的質(zhì)量標準。

2.陽性參考品符合率：至少10份以上結(jié)核分枝桿菌涂片和（或）培養(yǎng)陽性的結(jié)核病患者（菌陽）的新鮮外周抗凝血樣本；至少10份以上結(jié)核分枝桿菌涂片和（或）培養(yǎng)陰性的臨床確診結(jié)核病患者（菌陰）的新鮮外周抗凝血樣本，其陽性參考品符合率應(yīng)不低于75%。

3.陰性參考品符合率：至少15份無結(jié)核病臨床癥狀的健康志愿者的新鮮外周抗凝血樣本，其陰性參考品符合率應(yīng)不低于75%。具體要求：無結(jié)核病臨床癥狀的健康志愿者應(yīng)包含不同等級的PPD皮試人群，即應(yīng)包含PPD皮試強陽性者（72 h硬結(jié)或紅暈直徑≥15 mm或伴有水泡）、PPD皮試陽性者（72 h硬結(jié)或紅暈直徑≥5 mm）和PPD皮試陰性者（72 h硬結(jié)或紅暈直徑＜5 mm）這3種類型。

4.精密性：（1）ELISPOT方法的精密性檢測：①批內(nèi)精密性。如精密性參考品為新鮮血樣，則需取至少1例臨床確診的結(jié)核分枝桿菌涂片和（或）培養(yǎng)陽性患者樣本進行檢測，樣本在1個批次內(nèi)進行至少10次重復性實驗，CV值應(yīng)不高于25%。考慮到樣本為新鮮血液，1份樣本很難滿足3個批次的用量，可以取3份樣本分別進行3個批次的實驗。如精密性參考品為企業(yè)凍存的外周血單個核細胞樣品，則需要復蘇細胞后進行檢測，樣本在1個批次內(nèi)進行至少10次重復性實驗，CV值應(yīng)不高于25%。此實驗是以斑點數(shù)來計算CV值，建議精密性樣品的斑點數(shù)能控制在30～150個之間。②批間精密性。如樣本為新鮮血液，1份樣本很難滿足3個批次的用量，可以不做批間精密性檢測。如企業(yè)送檢參考品為凍存的細胞樣品，則可以進行此項檢定，批間的CV值應(yīng)不高于30%。各生產(chǎn)企業(yè)可視質(zhì)量控制情況而定。（2）ELISA方法的精密性檢測：應(yīng)用刺激后血漿或者企業(yè)送檢的精密性參考品作為樣品進行檢測，每批次至少重復測試10次，連續(xù)測試3個批次，計算CV值，批內(nèi)和批間的CV值均應(yīng)不高于20%。

5.最低檢出量：應(yīng)以相應(yīng)的參考品或者參考品的稀釋液為樣本，平行測定至少10份，計算其吸光度值（A值）的均值和標準差（SD），利用劑量-反應(yīng)曲線計算出“A值均值+ 2SD”時對應(yīng)的濃度值為最低檢出量。或者以研究數(shù)據(jù)結(jié)果直接定出最低檢出量。各生產(chǎn)企業(yè)可視質(zhì)量控制情況而定。

6.線性：在線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)不低于0.98。

7.準確性：在線性范圍內(nèi)，以國際標準品（或企業(yè)校準品）為準確性參考品進行檢測，參考品的實測值與標識值的偏差應(yīng)在±20%范圍內(nèi)?；蛘咭云渌m宜方法進行檢測。

8.穩(wěn)定性：穩(wěn)定性的檢測可以用熱穩(wěn)定性試驗來替代，溫度一般選（37±1）℃，放置時間可根據(jù)試劑盒的效期而定，一般有效期6個月的產(chǎn)品37℃加熱3 d，有效期12個月的產(chǎn)品37℃加熱至少6 d，有效期18個月的產(chǎn)品37℃加熱至少9 d。然后進行“1～7”的檢測項并符合規(guī)定。

ELISPOT方法檢測試劑盒需進行“1～4”的檢測項，ELISA方法檢測試劑盒需進行“1～8”的檢測項。

臨床研究

一、基本原則

1.基本要求：結(jié)核分枝桿菌IFN-γ體外檢測需采用血液進行，采集時應(yīng)征求受試者的同意，并簽署知情同意書。

2.臨床研究單位及人員的要求：結(jié)核分枝桿菌IFN-γ體外檢測試劑的臨床研究一般應(yīng)在至少2家以上（含2家）設(shè)有結(jié)核病專科的省級（或直轄市）醫(yī)療衛(wèi)生單位完成。

臨床研究單位必須具有相應(yīng)專業(yè)的技術(shù)人員，必須具有與研究試劑相適應(yīng)的儀器設(shè)備（ELISPOT讀板儀除外）。

二、臨床研究設(shè)計原則

1.結(jié)核病確診標準：依據(jù)《肺結(jié)核診斷標準 WS288-2008》［6］，肺結(jié)核的診斷是以細菌學實驗室檢查（涂片、培養(yǎng)）為主，結(jié)合胸部影像學、流行病學、臨床表現(xiàn)，以及結(jié)核菌素試驗和組織病理檢查等必要的輔助檢查與鑒別診斷，進行綜合分析作出的。

2.研究對象的選擇與評價：無論是“新診斷試劑產(chǎn)品”和“已有同品種批準上市產(chǎn)品”臨床研究實驗對象的選擇均應(yīng)符合《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導原則》中“1.3項”的規(guī)定，即研究對象應(yīng)包括兩組：一組是用金標準確定為有某病的患者組；另一組是用金標準證實無該病的患者或正常人群，作為對照組?；颊呓M應(yīng)包括該病種的不同患者，如癥狀典型和非典型的，病程早、中、晚期的，病情輕、中、重型的，不同年齡層次的，等等，以便能反映該病的全部特征。對照組應(yīng)包括確定無該病的患者，且易與本病相混淆疾病的患者。

針對該類試劑盒的特點，筆者建議其臨床實驗對象的選擇應(yīng)與上市后臨床擬使用人群相一致。疑似結(jié)核病患者入組后，依據(jù)《肺結(jié)核診斷標準WS288-2008》［6］進行診斷，將接受醫(yī)囑一個療程化療者列為結(jié)核病患者組，用于評價產(chǎn)品敏感度；其余列為非結(jié)核病患者組，用于評價產(chǎn)品特異度。在實驗結(jié)束仍有極少數(shù)無法診斷結(jié)核病者可予以剔除。

鑒于該類試劑盒有診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群的功能，因此建議增加正常人群為對照組，對該人群檢測特異性干擾素的同時進行PPD皮膚實驗或其他適宜的免疫學方法檢測，以便于了解當?shù)亟Y(jié)核病流行的背景資料，并且還能進行試劑盒診斷結(jié)果與PPD皮膚實驗或其他適宜方法診斷的陰性、陽性、強陽性等不同等級人群的相關(guān)性分析。

臨床評價結(jié)束后，以結(jié)核病患者組來計算試劑盒的診斷敏感度；而非結(jié)核病患者將與正常人群合并為實驗對照組，用來計算試劑盒的診斷特異度。其中結(jié)核病患者組建議可進行以下分析：結(jié)核病患者（含菌陽與菌陰患者）陽性檢出率分析；菌陽樣本［涂片和（或）培養(yǎng)陽性］的總檢出率分析、菌陰樣本［涂片和（或）培養(yǎng)陰性］的總檢出率分析；菌陽樣本還可分別進行涂片陽性與培養(yǎng)陽性樣本的陽性檢出率分析，如有必要還可進一步進行涂陽培陽、涂陰培陽、涂陽培陰的詳細分析。

對部分特異性干擾素檢測為陰性的結(jié)核病患者，建議對其免疫學狀態(tài)、年齡、體質(zhì)、是否使用免疫抑制劑等可能影響檢測結(jié)果的因素進行分析。對部分細菌學為陽性、特異性干擾素檢測為陰性的結(jié)核病患者，宜進行分型檢測，分析是否為非結(jié)核分枝桿菌所致。

臨床評價中采用已批準上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑時，應(yīng)以對結(jié)核病患者與非結(jié)核病患者的臨床診斷標準作為評價指標，比較兩種試劑的敏感度與特異度的差異有無統(tǒng)計學意義。

3.樣本量：依據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》［7］第十二條規(guī)定，結(jié)核分枝桿菌IFN-γ體外檢測試劑屬第三類產(chǎn)品。《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導原則》［8］中關(guān)于臨床研究樣本量的規(guī)定：第三類產(chǎn)品的臨床研究的總樣本數(shù)至少為1000例。

4.樣本的采集：以肝素鈉或肝素鋰抗凝的采血管進行樣本采集。不建議采用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝的采血管進行樣本的采集，這將會增加背景，從而對結(jié)果判讀造成干擾。

5.對比試劑：應(yīng)選擇使用已經(jīng)通過我國相關(guān)機構(gòu)認證的同類型產(chǎn)品，同時應(yīng)充分了解所選擇產(chǎn)品的技術(shù)信息，包括方法學、臨床使用目的和范圍、主要性能指標、標準品或校準品的溯源情況、推薦的參考值（參考范圍）等，以便對試驗結(jié)果能夠進行科學的分析。

關(guān)于臨床研究報告的撰寫

臨床研究報告的格式及書寫內(nèi)容應(yīng)包括以下項目。

一、首篇

首篇是每份臨床研究報告的第一部分，所有單個的臨床研究報告均應(yīng)包含該部分內(nèi)容。主要有封面標題、目錄、研究摘要、試驗主要研究人員的姓名、單位和在研究中的職責及其簡歷（列于附件中）、縮略語等。

二、正文內(nèi)容和報告格式

1.基本內(nèi)容：應(yīng)包括引言、研究目的、試驗管理、試驗設(shè)計、臨床研究結(jié)果及分析、討論和結(jié)論等。其中試驗設(shè)計中應(yīng)包括：樣本量及樣本量確定的依據(jù)；樣本選擇依據(jù)、入選標準、排除標準和剔除標準；樣本采集、保存、運輸方法等；金標準或?qū)Ρ仍囼灝a(chǎn)品的確立；臨床研究用所有產(chǎn)品的名稱、規(guī)格、來源、批號、效期及保存條件，對比試驗產(chǎn)品的注冊情況；質(zhì)量控制方法；臨床研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析方法；研究過程中方案的修改。

2.情況說明：有關(guān)臨床研究中特別情況的說明。

3.附件：應(yīng)包括臨床研究中所采用的所有診斷試劑產(chǎn)品的使用說明書、臨床研究中的所有試驗數(shù)據(jù)，以及主要參考文獻等。

討 論

以上文章中的“原材料、主要生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制和臨床研究”四部分主要是針對我國相關(guān)試劑和試劑盒的研究進行的探討。如國外同類試劑或試劑盒在我國進行注冊申請，需符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》［7］的相關(guān)規(guī)定。《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》第十條規(guī)定“境外生產(chǎn)企業(yè)還應(yīng)當符合生產(chǎn)國或地區(qū)相應(yīng)的質(zhì)量管理體系要求?！薄扼w外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》第三十二條規(guī)定“申請境外產(chǎn)品注冊，需要提供境外的臨床試驗資料。申請人應(yīng)當按照臨床試驗的要求，同時考慮不同國家或地區(qū)的流行病學背景、病原微生物的特性、不同種屬人群所適用的正常參考值（或參考范圍）等諸多因素，在中國境內(nèi)進行具有針對性的臨床試驗?！币虼?，如國外同類試劑或試劑盒在我國進行申請注冊，臨床研究可參考文章中的相關(guān)部分。至于國外同類試劑或試劑盒的進口注冊檢定，要求與國內(nèi)同類制品一樣，可參考上述“型式檢驗”部分。

參 考 文 獻

［1］Centers For Disease Control and Prevention.Updated guidelines for using interferon gamma release assays to detect Mycobacterium tuberculosis infection——United states，2010.Atlanta：Centers For Disease Control and Prevention，2010：59（RR-5）.

［2］中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典三部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：333.

［3］中國生物制品標準化委員會.中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準.北京：化學工業(yè)出版社，2000.

［4］中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局.體外診斷試劑說明書編寫指導原則.北京：中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局，2007.

［5］中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局.醫(yī)療器械說明書、標簽和包裝標識管理規(guī)定.北京：中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局，2004.

［6］中華人民共和國衛(wèi)生部.WS288-2008 肺結(jié)核診斷標準.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

［7］中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局.體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）.北京：中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局，2007.

［8］中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程.北京：中國教育文化出版社，2006.

（收稿日期：2013-06-12）

（本文編輯：薛愛華）

·綜 述 ·

結(jié)核分枝桿菌基因突變檢測方法研究進展

柳正衛(wèi) 黃玉 趙雁林

【摘要】結(jié)核分枝桿菌全基因組測序工作的完成，為開展結(jié)核病基因研究提供了理論基礎(chǔ)，對結(jié)核分枝桿菌基因突變的研究也成為當前結(jié)核病研究領(lǐng)域的熱點之一。高分辨率熔解（high-resolution melting，HRM）、基因芯片、DNA直接測序等分子生物學新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為結(jié)核分枝桿菌基因突變研究提供了更有效的方法?，F(xiàn)綜合國內(nèi)外近年來的文獻，分類介紹應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌基因突變檢測的各種方法的原理、應(yīng)用情況等，同時也對GeneXpert、結(jié)核分枝桿菌線性探針（line probe assay，LiPA）、基因芯片等當前比較成熟并有望得到廣泛應(yīng)用的商品化基因突變檢測技術(shù)進行介紹。

【關(guān)鍵詞】分枝桿菌，結(jié)核； 突變； 序列分析，DNA； 寡核苷酸序列分析

【Abstract】The completion of the Mycobacterium tuberculosis genome sequencing provides the evidence for the study of genetic nature of tuberculosis bacterium，and the study of Mycobacterium tuberculosis gene mutations has become one of hotspots in the field of TB research at present.The development and application of new technology of molecular biology，such as high-resolution melting（HRM），gene chip，DNA direct sequencing have provided more effective methods for Mycobacterium tuberculosis gene mutation research.This paper reviewed relative literatures in recent years at home and abroad，introduced in category the principles and application of different methods in Mycobacterium tuberculosis gene mutation detection.Gene mutation detection technology such as GeneXpert，Mycobacterium tuberculosis linear probe（line probe assay，LiPA），gene chip，which are more mature and are expected to be widely used at present were introduced as well.

【Keywords】Mycobacterium tuberculosis； Mutation； Sequence analysis，DNA； Oligonucleotide array sequence analysis

結(jié)核病是一種嚴重危害人類健康和社會發(fā)展的慢性傳染病，自1993年WHO宣布全球緊急狀態(tài)以來，結(jié)核病的疫情一直面臨著多重挑戰(zhàn)。H37Rv株的全基因組測序工作［1-2］的完成，使人們開始從分子水平認識和研究結(jié)核分枝桿菌的遺傳本質(zhì)，為開展結(jié)核病基因研究提供了理論基礎(chǔ)，各種針對結(jié)核分枝桿菌耐藥基因、毒力相關(guān)基因、遺傳變異等方面的研究都取得了突變性進展，開發(fā)出的新診斷技術(shù)、新疫苗、新藥物成為人類戰(zhàn)勝結(jié)核病新的希望和機遇。這些新診斷技術(shù)、新疫苗、新藥物的研究大多建立在結(jié)核分枝桿菌相關(guān)重要基因的突變和功能研究基礎(chǔ)上，因此，對基因的突變研究顯得尤為重要，成為當前結(jié)核病研究領(lǐng)域的熱點。過去十幾年，分子生物學的迅猛發(fā)展產(chǎn)生了多種結(jié)核分枝桿菌基因突變檢測方法，這些技術(shù)依據(jù)檢測原理可分成不同的種類。筆者就結(jié)核分枝桿菌基因突變檢測方法做一綜述，特別對近期出現(xiàn)的新技術(shù)進行詳細討論。

一、以構(gòu)象為基礎(chǔ)的檢測方法

1.聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）：PCR-SSCP是1989年由Orita等［3］創(chuàng)建的篩查點突變的一種技術(shù)，是一種簡單、快速、經(jīng)濟的點突變篩查手段。其基本原理是單鏈DNA在某一種非變性環(huán)境中會形成二級結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基組成，即使單堿基變化都能導致這種空間構(gòu)象的改變導致在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳遷移率不同，產(chǎn)生不同的泳動帶，從而將正常鏈與突變鏈分離出來。該方法自發(fā)明后即被廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變的檢測［4-5］，直接用于痰標本耐藥基因的檢測也顯示了較好的敏感度和特異度［6-7］。該技術(shù)只能明確存在堿基置換，而確定其堿基置換的性質(zhì)必須經(jīng)過DNA測序，是測序之前突變篩查的常用手段。

2.變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）：DGGE最初由Fischer等［8-10］于20世紀80年代初期發(fā)明，主要是用于檢測DNA片段中的點突變。不同的雙鏈DNA片段因為其序列組成不同，其解鏈區(qū)域及各區(qū)域的解鏈條件變性劑濃度也不同。同樣長度但序列不同的DNA片段在遞增的變性劑濃度梯度中電泳時，會在各自解鏈區(qū)域的變性劑濃度處發(fā)生部分解鏈，導致遷移率改變，而將組成不同的DNA片段分開。值得注意的是，DGGE在分析每一特定的PCR片段之前，需要通過預試驗來確定其最佳的電泳條件，以獲得最大的分離度。用DGGE檢測結(jié)核臨床標本利福平耐藥，其基因型與測序結(jié)果符合率很高［11-12］。雖然該方法可以有效檢測基因突變，但是，目前該方法更多地應(yīng)用于微生物分子生態(tài)學研究的各個領(lǐng)域，成為研究微生物群菌落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學方法之一。

3.PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-restricted fragment length polymorphism，PCR-RFLP）：PCR-RFLP在結(jié)核領(lǐng)域最為人所熟知的應(yīng)用就是其DNA-指紋技術(shù)應(yīng)用于跨國結(jié)核病疫情的追蹤［13］，而其原理就是特定的限制性核酸內(nèi)切酶具有識別并剪切特定的DNA序列位點的能力。因此，特定的DNA被限制性內(nèi)切酶水解后其片段長度發(fā)生變化，通過瓊脂糖凝膠電泳可反映DNA特定區(qū)域的結(jié)構(gòu)改變，如點突變、缺失、插入和重排等，從而體現(xiàn)出各樣本間的差異性。該技術(shù)操作簡便，僅為PCR加上限制性內(nèi)切酶，復現(xiàn)性良好，可檢出1個堿基的突變。研究者進行了一系列試驗來檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，分析特定基因位點的點突變，結(jié)果顯示該技術(shù)具有高度的特異度［14-16］。

二、以熒光共振能量傳遞為基礎(chǔ)的檢測方法

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）是用于對生物大分子之間相互作用定性、定量檢測的一種有效方法。當一個供體熒光分子的熒光光譜與另一個受體熒光分子的激發(fā)光譜相重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減，稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移。基于FRET的幾種突變檢測方法需要針對特定的突變位點或多態(tài)性位點設(shè)計并合成序列或位點特異性探針，因此，該類方法大多用于已知突變位點或是對位點的多態(tài)性較清楚的突變檢測。

1.Taqman探針法：用于對特定位點單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的檢測。應(yīng)用一對雙標記Taqman探針，分別針對雙等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針擴增出各自對應(yīng)的基因型；用兩種熒光染料Fam、Hex（Vic）分別標記這兩種探針，就可以在一次PCR反應(yīng)中完成對單個SNP位點的基因型判定。

2.分子信標（molecular beacon）：分子信標是可以特異識別核酸序列的具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸熒光探針，探針兩端分別標上一個熒光基團和淬滅基團，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近，并且不會產(chǎn)生熒光。當有靶序列存在的時候，靶序列和分子信標的探針序列雜交形成有一定剛性的雙螺旋結(jié)構(gòu)，導致分子信標的構(gòu)象改變，干的部分打開，熒光基團與猝滅基團分開，二者之間的能量轉(zhuǎn)移終止，在有相應(yīng)的單色光激活時，熒光基團發(fā)出熒光。熒光強度與靶序列的多少成正比［17］。分子信標不僅可以用于基因的定量、定性檢測，還可以用于基因點突變等的分析等。

三、異源雙鏈結(jié)構(gòu)分析為基礎(chǔ)的方法

異源雙鏈核酸是指來源不同的2種或2種以上的核酸分子同時存在于同一溶液中時，其同源區(qū)域可借堿基配對形成雙鏈核酸。異源雙鏈內(nèi)由于存在堿基錯配或不配區(qū)域，在鏈內(nèi)局部可形成凸起或泡，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，其泳動速度變慢，雙鏈同源性越高，其泳動越快。

1.異源雙鏈分析法（heteroduplex analysis，HA）：突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其堿基錯配處會形成1個突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈DNA不同的遷移率，從而達到診斷堿基突變的目的。該法與SSCP相似，只適合于小片段的分析，所不同的是SSCP分離的是單鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA。但HA對一些不能用SSCP檢出的突變有互補作用，兩者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高。Saribas等［18］認為該方法有很高的敏感度和特異度，可以快速檢測利福平耐藥。

2.變性高效液相色譜技術(shù)（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）：DHPLC方法是一種檢測基因突變的新方法，主要用來分析異質(zhì)性雙鏈結(jié)構(gòu)。它利用野生型和突變型DNA形成異源雙鏈，在變性條件下，依靠雙鏈堿基組成的構(gòu)象差異，最終表現(xiàn)為洗脫峰形的差異顯示突變的有無來進行分析。該技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因突變檢測研究中得到了廣泛的應(yīng)用［19-21］。DHPLC突變檢測技術(shù)是高通量篩選DNA序列變異的最新技術(shù)，在結(jié)核病研究領(lǐng)域，除耐藥基因檢測外，還可以用于基因分型、序列多態(tài)性分析等［22-23］，但是該技術(shù)所需設(shè)備價格昂貴，只能在一些大型的實驗室中使用，限制了此方法的應(yīng)用，同時，該技術(shù)只能檢測雜合突變是其主要不足之處。在SNP篩查的檢測通量、敏感度與成本等方面與最新的高分辨率熔解（high resolution melt，HRM）技術(shù)相比都明顯落后。

3.Surveyor酶法：Surveyor酶是植物中提取的核酸內(nèi)切酶，對DNA錯配部位有高度選擇性，它與普通的核酸內(nèi)切酶不同，其酶切位點沒有核苷酸序列的特異性，只識別異源雙鏈中單個堿基錯配形成的泡或未配對的多個堿基形成的環(huán)，從錯配部位的每一條鏈的3′端切斷雙鏈DNA。無基因突變存在時，樣本與野生型PCR產(chǎn)物雜交形成同源雙鏈，Surveyor酶找不到酶切位點而不能發(fā)揮作用，電泳圖譜上僅為1條帶；有點突變存在時，雜交后產(chǎn)物為配位完好的同源雙鏈和錯配有凸起的異源雙鏈。Surveyor酶可將異源雙鏈從錯配部位切開，電泳圖呈現(xiàn)3條帶，1條為同源雙鏈條帶，另外2條為被切斷的異源雙鏈，2條鏈的長度總和等于同源雙鏈的長度。如果異源雙鏈中有多個錯配部位，則Surveyor酶可有多個作用位點，產(chǎn)生不同長度、不同種類的酶切片段，呈現(xiàn)多種帶形的電泳圖譜［24］。Surveyor酶法無需大型設(shè)備，僅使用普通的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳即可，也可通過瓊脂糖凝膠電泳判斷有無突變的存在。方法簡便穩(wěn)定，便于推廣。該技術(shù)在其他疾病的基因突變中有較多的應(yīng)用［25］，在結(jié)核耐藥基因突變方面應(yīng)用較少。

4.PCR-通用異源雙鏈擴增子（PCR-universal heteroduplex generator，PCR-UHG）：Williams等［26］創(chuàng)立了并評價利用PCR-UHG技術(shù)快速檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性的方法：先用巢式PCR擴增特異的rpoB基因片段，再與根據(jù)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因Rif區(qū)合成的通用異源雙鏈擴增子UHG探針雜交，如果標本中的結(jié)核分枝桿菌rpoB基因有突變，則會產(chǎn)生異源雙鏈，通過電泳可分離異源雙鏈，確定其是否有利福平耐藥性。此方法對涂片染色陽性、未經(jīng)治療的患者尤為適合。Mayta等［27］進一步評價了該技術(shù)在發(fā)展中國家診斷痰涂片陽性肺結(jié)核和快速發(fā)現(xiàn)耐多藥結(jié)核病的可行性，認為其具有高度的特異度、敏感度和預測值。

四、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）

CE是近幾年發(fā)展起來的高效快速分離、分析技術(shù)。在散熱效率高的極細的毛細管內(nèi)，在有或無凝膠的篩分機制和高強度電場的雙重作用下，DNA片段因離子表面積和分子外形的變異導致的遷移時間不同而檢測突變。CE技術(shù)能夠分析長至數(shù)千的堿基片段，可以同時處理多個樣本，而且樣本的需求量極少。基于毛細管電泳的單鏈構(gòu)象異構(gòu)多態(tài)性（CE-SSCP），結(jié)合了SSCP檢測基因突變的簡單快速和CE的儀器自動化，實現(xiàn)了快速和自動在rpoB基因、inh A-mabA基因調(diào)節(jié)區(qū)、katG基因檢測單堿基突變［28-29］。

五、高分辨率熔解（high-resolution melting，HRM）

HRM是新近發(fā)展起來的SNP及突變檢測工具，也是當前比較熱門的基因突變檢測方法。HRM是由美國猶他大學Carl Wittwer實驗室與美國Idaho公司于2003年共同合作開發(fā)的一種建立在實時熒光定量PCR基礎(chǔ)上的技術(shù)［30-31］，不同核酸分子的GC含量、GC分布不同，因此雙鏈DNA分子在加熱變性時會有自己熔解曲線的形狀和位置。HRM就是根據(jù)熔解曲線的不同，根據(jù)解鏈溫度曲線與標準曲線的對照，準確區(qū)分野生型、雜合突變、純和突變。此法不受突變堿基位點與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運行高分辨率熔解，即可完成對樣品基因型的分析，閉管檢測，避免了污染造成的假陽性，同時可以檢測已知和未知SNP，但是不能測出具體位置和類型。HRM技術(shù)在結(jié)核病耐藥領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，利用HRM對常見抗結(jié)核藥物耐藥基因的檢測［32-34］，并已有相關(guān)的商品化檢測試劑。

六、DNA直接測序方法

DNA測序技術(shù)是分子生物學檢測的金標準，是檢測結(jié)核分枝桿菌基因突變最直接的方法。該技術(shù)不斷發(fā)展，從最初的雙脫氧核苷酸末端終止測序法發(fā)展到今天第三代測序技術(shù)，高通量測序技術(shù)日漸成熟，為快速測序檢測突變提供了技術(shù)支持。

七、商品化的突變檢測技術(shù)

1.GeneXpert檢測系統(tǒng)：該系統(tǒng)由美國Cepheid公司研發(fā)，整合了傳統(tǒng)PCR檢測所需的3個步驟（樣品制備、擴增和檢測），并把它們自動化，提供樣品到GeneXpert的反應(yīng)盒，系統(tǒng)自動進行核酸提取、核酸擴增以及目標序列的檢測。作為 WHO推薦的一種檢測耐藥基因突變的方法，結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測（Xpert Mtb/ RIF）采用了GeneXpert檢測系統(tǒng)，是一種半巢式實時熒光定量PCR體外診斷技術(shù)，針對結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB的81 bp利福平耐藥核心區(qū)檢測其是否發(fā)生突變，診斷是否對利福平耐藥。2010年的多中心驗證評估結(jié)果表明，該檢測系統(tǒng)檢測利福平耐藥的敏感度和特異度高達97.6% 和98.1%［35］。

2.結(jié)核分枝桿菌線性探針技術(shù)（line probe assay，Li-PA）：LiPA是一種基于PCR擴增的方法，根據(jù)固相反向雜交原則設(shè)計的檢測方法，將靶DNA用帶有生物素的引物進行PCR擴增，帶生物素的PCR產(chǎn)物與膜固定的捕獲探針雜交，再加入交聯(lián)堿性磷酸酶的鏈霉親和素，洗去未結(jié)合的鏈霉親和素，加入底物顯色，由此來檢測靶DNA特定基因的堿基突變［36］。目前國際上應(yīng)用最多的LiPA是德國HAIN公司的GenoType MtbDRplus耐藥檢測試劑盒，通過檢測rpoB、KatG基因和inhA基因啟動子區(qū)的突變情況確定利福平和異煙肼的耐藥性，國際上很多實驗室對其進行了應(yīng)用評估，其特異度和敏感度均較高。

3.基因芯片技術(shù)：是指采用光導原位合成或微量點樣等方法，將核酸片段有序的固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定儀器對雜交信號強度進行分析，從而判斷樣品中靶分子數(shù)量。目前，已經(jīng)商品化DNA微陳列芯片法在國內(nèi)多中心驗證結(jié)果表明，該方法檢測利福平和異煙肼耐藥，其敏感度和特異度分別為87.56%和80.34%、97.95%和95.82%［37］。

基因突變檢測技術(shù)的快速發(fā)展，可以從分子水平來探索和研究結(jié)核分枝桿菌的各種遺傳本質(zhì)。雖然有多種檢測技術(shù)可供選擇，但是各種檢測技術(shù)仍然存在一定的局限性。因此，建立和選擇一種快速、有效、經(jīng)濟的方法仍是今后一段時間內(nèi)的目標。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2013-07-15）

（本文編輯：范永德）

·綜 述 ·

學校結(jié)核病暴發(fā)控制策略研究進展

路希維

【摘要】結(jié)核病暴發(fā)是我國面臨的嚴重校園公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。筆者對學校結(jié)核病疫情面臨的挑戰(zhàn)、現(xiàn)場流行病學調(diào)查，以及結(jié)核病暴發(fā)處置的相關(guān)問題進行了綜述，重點概述了結(jié)核病潛伏感染的篩檢手段與干預措施研究進展。歸納得出：肺結(jié)核患者早期發(fā)現(xiàn)是控制結(jié)核病暴發(fā)的基本手段；暴露關(guān)系與PPD試驗相結(jié)合是評價結(jié)核潛伏感染的有效手段；預防治療方案的短程化與全程管理是提高潛伏感染者治療依從性的關(guān)鍵，等等，為制定科學的學校結(jié)核病防控技術(shù)策略提供參考。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核/預防和控制； 疾病暴發(fā)流行/預防和控制； 結(jié)核菌素試驗； γ干擾素釋放試驗

【Abstract】Tuberculosis outbreak is one of serious public health challenges in schools in China.This article reviews challenges that tuberculosis control faces in school，field epidemiologic surveys and measures dealing with tuberculosis outbreaks.It summarizes particularly the research progress of screening tools and treatment of latent tuberculosis infection and concludes that early detection of pulmonary tuberculosis cases is the fundamental approach of tuberculosis outbreak control，combination of exposure with TST is an effective means to evaluate the latent tuberculosis infection，short-term chemotherapy and full administration are critical approaches to improve patient compliance.This article provides a reference for the development of scientific strategy on tuberculosis control in school.

【Keywords】Tuberculosis/prevention&control； Disease outbreaks/prevention&control； Tuberculin test； Interferon-gamma release tests

近年來，我國學校結(jié)核病疫情防控形勢嚴峻，結(jié)核病暴發(fā)事件頻有發(fā)生，干擾了正常的學習秩序，嚴重影響了在校師生的身體健康，創(chuàng)建高效的疫情處置技術(shù)策略已成為當務(wù)之急。目前，我國在學校結(jié)核病暴發(fā)的研究尚處于起步階段，現(xiàn)將國內(nèi)外研究進展綜述如下。

一、結(jié)核病暴發(fā)的相關(guān)概念解釋

（一）結(jié)核病患者聚集（tuberculosis clusters）

是特定人群、時間和空間上發(fā)生的不尋常的結(jié)核病患者聚集，患者數(shù)可超過或不超過預期［1］。患者聚集必須通過流行病學調(diào)查進一步查明原因。因此結(jié)核病聚集性發(fā)病往往作為現(xiàn)場流行病學調(diào)查前對疫情的暫時性描述，不能作為最終的事件描述。

（二）結(jié)核病暴發(fā)（tuberculosis outbreak）

結(jié)核病暴發(fā)是在特定時間、地點和人群出現(xiàn)了多例具有流行病學關(guān)聯(lián)的結(jié)核病患者，使一個集團內(nèi)結(jié)核病發(fā)病數(shù)量超過預期［2］。我國尚未制定結(jié)核病暴發(fā)的具體流行病學標準。美國CDC［3］認為具備以下條件之一均可稱之為結(jié)核病暴發(fā)：（1）在接觸者調(diào)查中發(fā)現(xiàn)2例或2例以上結(jié)核病患者；（2）在1年內(nèi)發(fā)生2例或2例以上具有流行病學關(guān)聯(lián)的患者。在確定結(jié)核病暴發(fā)之前需通過檢測菌株基因類型進一步證實傳播關(guān)系。

（三）結(jié)核病集團感染

結(jié)核病集團感染是指由于結(jié)核病傳染源的存在，使一個集團中的接觸者感染結(jié)核分枝桿菌的人數(shù)超過正常分布。該名詞在國內(nèi)廣泛被使用，國外文獻檢索沒有發(fā)現(xiàn)“結(jié)核病集團感染”這一特定稱謂。實際上集團感染是結(jié)核病暴發(fā)的同義語，但由于其描述了結(jié)核病暴發(fā)的基本屬性，并側(cè)重于感染者，具有特殊的意義，仍存在繼續(xù)使用的必要。結(jié)核病集團感染者與一般的潛伏感染者不同，具有以下特點：（1）具有顯性傳染源和固定結(jié)核分枝桿菌屬性。（2）傳播關(guān)系相對明確，疫情三間分布特點較為清晰。（3）接觸者群體經(jīng)歷了新近的暴露，已經(jīng)處于發(fā)病的窗口期［4］。由于感染后前2年發(fā)生結(jié)核病的概率最高，在結(jié)核病集團感染發(fā)生后的一段時間內(nèi)（一般為2年）具有較高的續(xù)發(fā)率，因此集團感染的控制是結(jié)核病暴發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。

（四）結(jié)核病突發(fā)公共衛(wèi)生事件（tuberculosis public health emergencies）

是指突然發(fā)生，造成或者可能造成社會公眾健康嚴重損害的重大結(jié)核病疫情。衛(wèi)生部2010年將一所學校在一個學期內(nèi)發(fā)生10例或10例以上具有流行病學關(guān)聯(lián)的結(jié)核病患者或出現(xiàn)死亡患者時定義為結(jié)核病突發(fā)公共衛(wèi)生事件［5］。

結(jié)核病暴發(fā)、結(jié)核病集團感染和結(jié)核病突發(fā)公共衛(wèi)生事件三者既有關(guān)聯(lián)也有區(qū)別。結(jié)核病暴發(fā)必然產(chǎn)生集團感染，但集團感染未必都導致結(jié)核病暴發(fā)。但如果集團感染處理不當，將導致結(jié)核病暴發(fā)或暴發(fā)升級，結(jié)核病突發(fā)公共衛(wèi)生事件提示結(jié)核病暴發(fā)處于嚴重的級別，反應(yīng)了公共屬性。因此三者互為影響，密不可分。

二、結(jié)核病暴發(fā)防控面臨的挑戰(zhàn)

（一）結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)延遲

結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)延遲會導致患者病情加重，并發(fā)癥增多，并使接觸者經(jīng)受更長時間的暴露，增加了傳播的風險。因此，延誤診斷是控制結(jié)核病流行最重要的障礙。在中等收入國家和高收入國家，結(jié)核病患者首診延誤時間均超過15 d，發(fā)展中國家的情況更為嚴重［6］。據(jù)2010年全國結(jié)核病流行性病學抽樣調(diào)查顯示，無癥狀隱匿性肺結(jié)核患者呈日益增多趨勢?；颊咧杏邪Y狀就診者僅占47%［7］，因此首診延誤已成為學校結(jié)核病防治急需解決的問題。另外，衛(wèi)生系統(tǒng)延誤診斷也不容忽視，主要包括校醫(yī)院、各級綜合性醫(yī)療機構(gòu)、結(jié)核病定點醫(yī)療機構(gòu)的確診延遲和疫情報告延遲等。Sreeramareddy等［8］認為中國的肺結(jié)核延誤（首診延誤與衛(wèi)生系統(tǒng)延誤之和）診斷時間高達25～71 d。延遲時間如果超過結(jié)核病發(fā)病的窗口期，即使立即啟動患者接觸者篩查工作，也無法遏制結(jié)核病暴發(fā)的發(fā)生。因此校園結(jié)核病發(fā)現(xiàn)策略必須以早期發(fā)現(xiàn)、早期干預為目的，通過完善結(jié)核病防治工作流程和網(wǎng)絡(luò)，加強健康促進，對校醫(yī)進行技術(shù)指導，以提高患者發(fā)現(xiàn)的效率。

（二）學校結(jié)核病暴發(fā)的環(huán)境因素

學校是典型的群體環(huán)境，人群密集、接觸密切，出現(xiàn)傳染源后，存在結(jié)核病暴發(fā)的風險。在冬季和春季，宿舍和教室的通風條件較差，出現(xiàn)傳染源后非常容易造成集團感染。結(jié)核病暴發(fā)初期主要表現(xiàn)為某個宿舍、班級的患者聚集，如不及時控制，疫情可通過公共區(qū)域（如圖書館、教室、宿舍和食堂）不斷擴散蔓延，導致結(jié)核病暴發(fā)的級別加重，同時還給疫情的調(diào)查和處置增加了難度。

（三）學校結(jié)核病暴發(fā)的人群特征

既往未接種卡介苗者、PPD硬結(jié)平均直徑＜5 mm者、HIV感染者均為結(jié)核病易感人群；在高中發(fā)生過結(jié)核病集團感染的高校入學新生為發(fā)病的高風險人群。另外，學生營養(yǎng)條件差、學習負擔重、休息不足也是易感結(jié)核病的因素。學生結(jié)核病防治知曉率低下導致就診延遲，容易導致結(jié)核病暴發(fā)的產(chǎn)生。

三、現(xiàn)場流行病學調(diào)查手段評價

（一）傳染源調(diào)查

1.傳染源：未經(jīng)治療的活動性肺結(jié)核，特別是痰抗酸桿菌涂片陽性或空洞型肺結(jié)核具有傳染性。痰涂片陰性也可以成為傳染源。國外對844所中學的結(jié)核病患者進行分析，13%的患者是由于被涂片陰性的患者感染所致［9］。鑒于我國結(jié)核分枝桿菌菌株的高耐藥率，建議常規(guī)開展痰結(jié)核分枝桿菌的耐藥測定。在有條件的地區(qū)所有確診患者應(yīng)進行快速耐藥基因檢測。

2.傳播鏈調(diào)查：隨著1998年結(jié)核分枝桿菌標準菌株（H37Rv）全基因測序工作的完成，使結(jié)核病分子流行病學得到快速發(fā)展。結(jié)核分枝桿菌基因分型技術(shù)在結(jié)核病暴發(fā)的傳播鏈調(diào)查中發(fā)揮了獨特作用。聚集性患者間的結(jié)核分枝桿菌DNA指紋圖譜分析顯示，相同的限制性片段長度多態(tài)性模式可被認為患者之間具有流行病學關(guān)聯(lián)［10］。通過對聚集性患者的結(jié)核分枝桿菌基因型測序可發(fā)現(xiàn)最初的傳染源，同時還可溯源并確立與該集團中既往發(fā)生的結(jié)核病患者的傳播關(guān)系。另外通過指紋圖譜的對比，可以區(qū)別新近感染抑或久遠感染和混合感染。一般來說，指紋圖譜譜帶相同或相似，提示為近期發(fā)生的同源暴發(fā)；譜帶相似之點較少，提示可能為久遠傳播；譜帶不同表示無傳播關(guān)系。

新近分子流行病學研究提示，結(jié)核性胸膜炎的基因族群聚集性率最高，分別達到肺結(jié)核和非呼吸系統(tǒng)結(jié)核病的2倍和3倍。提示結(jié)核性胸膜炎為新近的再感染［11］。

（二）接觸者調(diào)查

1.暴露隊列評估：相對于傳染源來說，密切接觸與非密切接觸者的結(jié)核病續(xù)發(fā)率存在明顯差別［12］，對接觸者進行暴露分級可以幫助我們迅速抓住重點環(huán)節(jié)，提高篩檢效率。傳染源接觸的暴露等級應(yīng)根據(jù)患者（或傳染源）的居住寢室和班級進行橫向和縱向調(diào)查。暴露分級方法多用于流行病學研究，但在結(jié)核病暴發(fā)控制方面具有意義。一般來說，暴露程度可分為高、中、低3個等級。寢室和班級內(nèi)的密切接觸者一般處于高暴露等級；中暴露等級一般為同一樓層居住或具有接觸關(guān)系的其他班級同學；低暴露等級一般為既不在同一樓層居住，又不在一個教室上課的學生。為提高調(diào)查效率，應(yīng)首先對中、高度暴露人群展開調(diào)查。篩檢完成后，通過對比分析不同樓層和班級的感染率，以及患者檢出率，可幫助發(fā)現(xiàn)隱性的傳播鏈，為重新評估感染的波及范圍和擴大篩檢范圍提供依據(jù)。一些出現(xiàn)二代患者的嚴重混合性傳播疫情，常出現(xiàn)多疫點暴發(fā)。此時仍需按照上述原則對新疫點的感染暴露情況做出評估。

2.患者篩檢：目前，胸部X線檢查（CXR）是結(jié)核病暴發(fā)后進行患者篩檢的常用手段。由于X線檢查對微小結(jié)節(jié)、微量積液，以及隱蔽部位病變檢出存在限度［13］，往往造成CXR篩查后不久，就有結(jié)核病續(xù)發(fā)患者產(chǎn)生［3］。螺旋CT具有較強的密度和空間分辨率，對肺結(jié)核病變內(nèi)部結(jié)構(gòu)、隱蔽部位、微小病變、淋巴結(jié)病變的檢出明顯優(yōu)于X線胸片，可將臨床的結(jié)核病患者從結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者中分離出來，采取積極的治療措施，達到減少續(xù)發(fā)患者產(chǎn)生的目的。Lee等［14］在 一 起 結(jié) 核 病 暴發(fā) 事 件 中，應(yīng) 用 高 分 辨 率CT （HRCT）對76名胸部X線檢查正常的疑似潛伏感染者進行篩檢，發(fā)現(xiàn)9例（12%）肺內(nèi)存在活動性病變。如果不進行HRCT掃描，這些患者將一直會被誤認為潛伏感染者，從而使用單藥預防的方案，則可能會導致耐藥性產(chǎn)生。近年來低劑量螺旋CT掃描技術(shù)的推廣，也為該技術(shù)在結(jié)核病暴發(fā)群體篩檢中提供了有價值的應(yīng)用前景。但國內(nèi)在使用CT進行患者篩檢上存在較多顧忌，主要有：對CT發(fā)現(xiàn)的微小病變是否按照肺結(jié)核進行疫情報告，對其選擇初治標化方案還是預防性治療方案，以及推廣CT篩檢所產(chǎn)生的放射性損傷問題等等。在尚未形成共識的情況下，為進一步提高患者檢出水平，對CXR篩檢陰性但有癥狀的接觸者進行CT檢查是一種折中的選擇。

3.潛伏感染者的篩檢：一般可采用PPD試驗與γ干擾素釋放分析試驗兩種手段。

1）PPD試驗：PPD作為一種評價潛伏感染的流行病學調(diào)查手段仍具有重要價值。暴發(fā)后PPD硬結(jié)平均直徑頻數(shù)分布曲線顯著右移，往往提示結(jié)核病集團感染的發(fā)生，這是一種較為傳統(tǒng)的做法。但PPD硬結(jié)平均直徑頻數(shù)分布曲線右移無法對結(jié)核病集團感染做出量化估計，對于輕度右移的情況需結(jié)合該集團“自然年感染率遞增水平”才能做出準確評估。

由于其受卡介苗接種及與其他環(huán)境分枝桿菌之間交叉免疫反應(yīng)的影響，PPD試驗無法將結(jié)核分枝桿菌感染從卡介菌、非結(jié)核分枝桿菌中區(qū)分出來，導致其特異度不足［15］。因此，對于個體而言，PPD試驗診斷潛伏性結(jié)核病感染（LTBI）存在限制，國際上將未接種BCG者普遍采用PPD硬結(jié)平均直徑≥5 mm作為陽性標準；接種BCG者以PPD硬結(jié)平均直徑≥10 mm作為陽性標準。我國將PPD硬結(jié)平均直徑≥15 mm作為陽性標準。PPD試驗的截斷值升高，雖然特異度隨之升高，但敏感度下降，在事件調(diào)查中可能遺漏真正的感染者。美國胸科協(xié)會（ATS）提出，兩年內(nèi)PPD硬結(jié)平均直徑凈增≥10 mm定義為PPD陽轉(zhuǎn)（TST conversion）［16］，提示為新感染。將PPD陽轉(zhuǎn)作為我國現(xiàn)行結(jié)核病潛伏感染標準的一個補充標準值得推薦。由于需對結(jié)核病暴發(fā)作出快速反應(yīng)，這里所說的PPD凈增值是基于結(jié)核病暴發(fā)首次PPD硬結(jié)平均直徑調(diào)查值與既往PPD硬結(jié)平均直徑值對比得出的，而非結(jié)核病暴發(fā)12周后的PPD硬結(jié)平均直徑的凈增值。

機體感染結(jié)核分枝桿菌后，PPD的反應(yīng)性時間間隔為8周（范圍為2～12周），這個時期被稱為“PPD反應(yīng)窗口期”［3］。對于急性發(fā)生的結(jié)核病暴發(fā)事件，新發(fā)結(jié)核病患者的PPD陽性率較低，此時進行接觸者PPD檢測，可能會造成假陰性過多，需要在12周后重新進行PPD檢測，這對于結(jié)核病暴發(fā)應(yīng)急處置工作來說無疑是一個挑戰(zhàn)。另外，PPD試驗在結(jié)核性胸膜炎診斷中也存在限度，西班牙的一組254例結(jié)核性胸膜炎患者中，只有66.5%的患者PPD陽性，香港的研究PPD陰性的比例達到1/2以上［17］。

2）γ干擾素釋放分析試驗：γ干擾素釋放分析試驗（IGRA）的技術(shù)原理是用卡介菌及非結(jié)核分枝桿菌所缺失的特異性蛋白CFP-10、ESAT6等作為抗原刺激物刺激結(jié)核分枝桿菌感染者外周血單個核細胞中的結(jié)核特異性活化T細胞分泌γ干擾素，通過定量或定性檢測手段判斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染。IGRA包括兩種檢測方法：干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫法（QuantiFERON-TB Gold，QFT-G）與結(jié)核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT）。IGRA不受卡介苗接種的影響，并且可將結(jié)核分枝桿菌感染從大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌感染中分離出來，因此特異度大大提高。綜合文獻報道，IGRA診斷活動性肺結(jié)核的敏感度為70%～80%，特異度為88%～97%［18］，與PPD試驗比較特異度顯著升高。美國2010年出版的IGRA檢測結(jié)核分枝桿菌感染的最新指南推薦，對于卡介苗接種人群應(yīng)使用IGRA進行感染調(diào)查［4］。多中心研究發(fā)現(xiàn)，IGRA與暴露等級相關(guān)性好，而PPD試驗差強人意［19-22］。日本對一起普遍接種卡介苗的學生群體在發(fā)生結(jié)核病暴發(fā)事件后進行PPD和QFT-G聯(lián)合檢測，接觸者中PPD試驗陽性率為93.2%，非接觸者為72.3%。接觸者中IGRA陽性率為33%，非接觸者中陽性率僅為1%，說明兩個群體明顯不同［22］。Arend等［22］針對一起超市發(fā)生的結(jié)核病暴發(fā)事件，聯(lián)合使用了PPD試驗、QFT-G和T-SPOT對接觸者進行了大樣本的觀察和研究，結(jié)果表明IGRA與接觸者的暴露水平密切相關(guān)，其中QFT-G效果更佳。路希維等［23］在一起學校結(jié)核病暴發(fā)事件中應(yīng)用PPD硬結(jié)平均直徑≥15 mm、PPD硬結(jié)平均直徑≥10 mm和IGRA等進行聯(lián)合感染檢測，結(jié)果顯示IGRA陽性、PPD硬結(jié)平均直徑≥10 mm與暴露水平具有相關(guān)性，雖然PPD硬結(jié)平均直徑≥10 mm能反映暴露水平，但由于陽性率過高，難以針對性地啟動感染控制而被從指標評價體系中排除。所有這些情況都間接證明，IGRA是一種迄今為止較為理想的結(jié)核病集團感染的篩查手段。由于IGRA試劑成本較高，需要政府將其納入學校結(jié)核病公共衛(wèi)生儲備才能得到推廣使用。

四、結(jié)核病暴發(fā)處置的相關(guān)問題

結(jié)核病暴發(fā)處置的目標是發(fā)現(xiàn)和治療所有與暴發(fā)相關(guān)的患者、及時啟動接觸者調(diào)查，以及對潛伏感染者進行醫(yī)學評估、隨訪，并保證規(guī)律完成預防性治療的療程。

（一）患者管理

患者的診斷治療和管理具體應(yīng)參照《結(jié)核病控制規(guī)劃實施指南》進行，這里不再贅述。所有確診和疑似患者均需進行短期隔離治療。充足的臨床證據(jù)表明，發(fā)生結(jié)核病暴發(fā)后隔離的目標患者為痰結(jié)核分枝桿菌涂片陽性和（或）培養(yǎng)陽性的患者。一旦有效的化學治療開始2周后，患者的傳染性幾乎消失［24］。衛(wèi)生部《學校結(jié)核病防控工作規(guī)范》規(guī)定，對于涂陽和重癥涂陰患者應(yīng)在完成2個月治療后方考慮復學，這在我國尚未普及耐藥快速檢測和結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)的情況下是一種較為明智的選擇。對于涂陰的輕癥患者，其復學的時間應(yīng)以不小于2周為宜。復學時影像學檢查和痰涂片檢查結(jié)果為重要的參考條件，同時進行痰結(jié)核分枝桿菌分子生物學檢測可有效解決痰涂片敏感度不高的問題。

（二）潛伏感染者管理

1.預防性治療對象調(diào)整：結(jié)核病暴發(fā)后，潛伏感染者是重點干預的對象。由于PPD試驗的限度，在確定預防性治療范圍時，不能機械地使用PPD試驗來設(shè)定集團潛伏感染者范圍，要結(jié)合與傳染源的暴露等級和接觸暴露時間等流行病學要素進行綜合分析。其中密切接觸是優(yōu)先考慮的因素，研究證實密切接觸者無論PPD試驗結(jié)果是否陽性，發(fā)病的概率均較高，需要進行藥物預防性治療［25］。ATS在潛伏感染診斷指南中［26］指出：在高暴露人群中PPD硬結(jié)平均直徑≥5 mm被認為是陽性標準；在中度暴露風險PPD硬結(jié)平均直徑≥10 mm被認為是陽性標準；在沒有感染風險時PPD硬結(jié)平均直徑≥15 mm被認為是陽性標準，該指南較好地解決了PPD的不足，對于結(jié)核病集團感染控制具有重要意義。另外，與活動性肺結(jié)核患者有近期密切接觸者，但仍處于12周的窗口期之內(nèi)，PPD試驗硬結(jié)反應(yīng)盡管是陰性的，也需評估進展為活動性肺結(jié)核的高風險并立即進行潛伏感染治療，在12周后應(yīng)重復進行PPD試驗測試，如果PPD試驗結(jié)果陽轉(zhuǎn)或凈增值增加則治療應(yīng)持續(xù)，如果PPD試驗持續(xù)陰性則終止預防［27-28］。

2.潛伏感染者預防性治療方案：常用的預防性治療方案包括2種：（1）單用異煙肼預防，療程6～9個月。（2）異煙肼聯(lián)合利福平預防，療程3個月。二者的化學預防效果大致相同［29］。國外多中心研究證實：口服異煙肼0.9 g、利福噴丁0.9 g，每周用藥1次，療程3個月（共計服藥12次）的預防方案，與9個月的單獨異煙肼預防結(jié)核病一樣有效，藥物不良反應(yīng)率為4.9%［30］，并有較理想的完成治療率（82.1%）。國內(nèi)劉玉清等［31］報道采用異煙肼0.6 g、利福噴丁0.6 g（體質(zhì)量50 kg以上），每周2次給藥，療程為3個月（共計服藥25次），完成療程率為90%，不良反應(yīng)率為3.3%，也取得了較好效果。總之，治療方案的短程化和降低服藥次數(shù)是提高治療依從性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在治療前，結(jié)核病防治機構(gòu)要對潛伏感染者進行用藥指導，并做好定期的血常規(guī)和肝功能復查。

3.治療的依從性與改進：潛伏感染者用藥管理是結(jié)核病防治人員面臨的主要挑戰(zhàn)［32］。治療依從性差的原因是多方面的：學生、教師和家長的認識不足，主觀性抵制、對不良反應(yīng)的擔心、治療的期限、經(jīng)濟負擔、重視程度不足、缺乏有效管理手段等，均可導致接受治療率不足和治療完成率下降。為進一步提高依從性，需通過執(zhí)行免費的預防干預政策，制定完善的不良反應(yīng)監(jiān)測體系，由校醫(yī)、輔導員（班主任）及學生志愿者組成的結(jié)核病防治網(wǎng)絡(luò)參與治療管理。另外，結(jié)核病防治機構(gòu)在學校有效地開展健康教育和訪視可提高感染者的系統(tǒng)治療率［33］。

五、學校結(jié)核病暴發(fā)的防控策略展望

在學校結(jié)核病暴發(fā)的防控工作方面，建議加大政府投入，實行免費的結(jié)核病暴發(fā)疫情干預政策，減輕患結(jié)核病學生和感染者治療負擔，提高服藥的依從性；加強結(jié)核病防治機構(gòu)與學校加強合作。教育部門要建立校園醫(yī)療機構(gòu)建設(shè)標準，建立由校醫(yī)、輔導員（班主任）和學生志愿者組成的結(jié)核病防控網(wǎng)絡(luò)，落實好晨檢和缺課登記制度，負責疑似患者追蹤、疫情報告，并及時將疑似患者轉(zhuǎn)診至結(jié)核病防治機構(gòu)。

在結(jié)核病暴發(fā)實施性研究方面應(yīng)解決以下幾個方面的問題：建立結(jié)核病暴發(fā)的Cohort隊列分析，進一步明確聚集性結(jié)核病患者的產(chǎn)生與發(fā)展的生物學和免疫學機制；進一步論證IGRA在結(jié)核病暴發(fā)潛伏感染者評價中的價值；繼續(xù)探尋可用于發(fā)病預警的新檢測手段；研發(fā)超短程的藥物預防方案并提高治療依從性；嘗試應(yīng)用分子流行病學手段用于結(jié)核病傳播關(guān)系調(diào)查等。

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（收稿日期：2013-05-28）

（本文編輯：薛愛華）

The clinical feature and treatment of pulmonary tuberculosis complicated with cor pulmonale in 140 Uygur young adults

SHANG Yong，HE Tao，Dilala TU'ERXUN，Shajidan YASHENG，CHEN Xiao-yu. The Second Department of Respiratory，first People's Hospital of Kashi，Xinjiang，Kashi 844000，China

SHANG Yong，Email：shangyongls123@sina.com

Objective To analyze the clinical feature and treatment of pulmonary tuberculosis（PTB）complicated with cor pulmonale in Uygur young adults in order to reduce misdiagnosis.Methods The course of disease，clinical feature and treatment of 140 Uygur young adults with PTBcomplicated with cor pulmonale aged 20-55 hospitalized in the First People's Hospital of Kashi in 2010—2012 were analyzed retrospectively.Results Among the 140 cases，there were 28 cases with hemoptysis，140 with pulmonary rales，68 with emphysema sign，81 with liver enlargement and leg edema and 45 with hydrothorax and seroperitoneum.Sixty-two cases were diagnosed with cor pulmonale by EGG，60 with P pulmonale，59 presented low voltage of QRS complex in the limb leads，51 with arrhythmia.Seventy-eight cases were diagnosed with cor pulmonale by color doppler echocardiography.After treatment，121 cases'condition improved and 19 cases died.Conclusion As Uygur young adults with PTB complicated with cor pulmonale have atypical symptoms，measures should be implemented for timely detection and standardized treatment to reduce mortality.

Tuberculosis，pulmonary/complications； Pulmonary heart disease； Young adults；Uygur nationality

Discussion on clinical trial，production and quality control of in vitro Mycobacterium tuberculosis IFN-γdetection reagents

DU Wei-xin，CHEN Bao-wen，XU Miao，YANG Lei，LUJin-biao，WANG Guo-zhi. National Institutesfor Food and Drug Control，Division of Bacterial Vaccines，Beijing 100050，China
Corresponding author：WANG Guo-zhi，Email：tbtestlab@126.com

Research progress on the detection methods of Mycobacterium tuberculosis gene mutatio

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LIU Zheng-wei*，HUANG Yu，ZHAO Yan-lin.*Department of TBControl and Prevention of Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention，Hangzhou 310051，China
Corresponding author：LIU Zheng-wei，Email：zhengweiliu@126.com

Research progress of control strategy on tuberculosis outbreak in school

LU Xi-wei. Dalian Tuberculosis Hospital，Dalian 116033，China

2013-03-13）

844000新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸二科

商勇，Email：shangyongks123@sina.com

“十二五”國家重大科技專項（2012ZX10004702）

作者單位：100050北京，中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室

通信作者：王國治，Email：tbtestlab@126.com

作者單位：310051杭州，浙江省疾病預防控制中心結(jié)防所［柳正衛(wèi)（中國疾病預防控制中心公共衛(wèi)生碩士研究生）、黃玉］；中國疾病預防控制中心結(jié)核病預防控制中心（趙雁林）

通信作者：柳正衛(wèi)，Email：zhengweiliu@126.com

作者單位：116033大連市結(jié)核病醫(yī)院