章 權(quán) 杭州市紅十字會醫(yī)院 杭州 310003章建華 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

·綜 述·

骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡及其調(diào)控基因的研究進展

章 權(quán) 杭州市紅十字會醫(yī)院 杭州 310003章建華 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

骨關(guān)節(jié)炎 軟骨細胞 細胞凋亡 基因

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種漸進發(fā)展的，表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和運動受限等癥狀的慢性進行性疾病。其發(fā)展的最終表現(xiàn)是：軟骨細胞和基質(zhì)出現(xiàn)變形，以及生化、分子水平、生物力學(xué)的改變，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的軟化、纖維化、潰瘍形成和缺失、軟骨下骨硬化、骨贅及軟骨下囊腫形成[1]。然而，OA的病因和發(fā)病機制至今尚未完全明確。近年來，國內(nèi)外的學(xué)者通過對OA患者的關(guān)節(jié)軟骨進行組織細胞學(xué)研究，從新鮮分離的軟骨細胞中發(fā)現(xiàn)了細胞凋亡（apoptosis）的現(xiàn)象，并且軟骨細胞凋亡的數(shù)量與OA的病程、病變程度具有高度一致性[2]。因此，軟骨細胞凋亡在OA的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用[3]。

1 軟骨細胞凋亡

細胞凋亡是有核細胞在基因調(diào)控下，依賴能量的細胞內(nèi)死亡程序激活而引發(fā)的細胞自然死亡、自我清除的過程，也稱程序性死亡。細胞凋亡典型的形態(tài)學(xué)特征包括：細胞核固縮、DNA片段化、染色體凝聚、胞膜起泡、細胞皺縮以及分解為膜包圍的小囊泡。

凋亡多用以清除無功能、受損害、衰老的細胞。正常的軟骨細胞中亦可見凋亡現(xiàn)象，但很少被檢出，一般多存在于軟骨表層[4]，是調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨生長發(fā)育、控制軟骨細胞功能狀態(tài)、維持關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定所必需的生理性過程[5]。過度凋亡則是病理性的和有害的，并被認為是OA發(fā)病的重要機制之一[6]。OA軟骨細胞凋亡多發(fā)生于關(guān)節(jié)軟骨的表層和中層[7]。但軟骨的深層可能也有細胞凋亡發(fā)生[8]。

2 軟骨細胞凋亡途徑

調(diào)控OA軟骨細胞凋亡有三種途徑：①線粒體途徑。線粒體受凋亡信號刺激后，呼吸鏈異常，膜電位下降，膜通透性增加，可溶性蛋白被釋放到細胞質(zhì)中，通過激活半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）途徑，引起細胞凋亡。②死亡受體途徑。死亡受體是一類腫瘤壞死因子受體家族的跨膜蛋白，與死亡配體特異性結(jié)合觸發(fā)細胞凋亡。常見的死亡受體有Fas、TN?FR1、DR3等，相應(yīng)的配體為FasL、TNF、Apo3L等。③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指由于各種原因引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，導(dǎo)致錯誤折疊或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集的病理狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可誘發(fā)突變蛋白的表達或局部缺血[9]，以致細胞凋亡。目前研究比較透徹和獲得公認的主要是死亡受體途徑中的Fas途徑和線粒體途徑中的NO途徑[10]。

3 軟骨細胞凋亡調(diào)控基因

3.1 P53基因 P53基因位于17號染色體，長約20kb，表達為53kD磷酸化蛋白。P53是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，分為突變型和野生型。野生型P53可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡，在細胞中呈陽性表達。它被認為是影響細胞周期和DNA修復(fù)的調(diào)節(jié)因子，并且在限制細胞生長、導(dǎo)致細胞凋亡過程中起關(guān)鍵信號的作用。當(dāng)P53在G1期（DNA分裂前期）檢查到DNA損傷，P53蛋白即阻止DNA復(fù)制，以提供足夠的時間使損傷DNA修復(fù)；如果修復(fù)失敗，P53蛋白則引發(fā)細胞凋亡。但P53發(fā)生突變后，由于其空間構(gòu)象發(fā)生改變，失去了對細胞生長、凋亡和DNA修復(fù)的調(diào)控作用，P53由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗颉?/p>

新的研究發(fā)現(xiàn)了P53調(diào)控的凋亡誘導(dǎo)蛋白-1（P53AIP-1）。P53AIP-1可在P53依賴性細胞凋亡中被過度表達。Hashimoto等[11]認為，在OA和正常軟骨細胞均有P53的表達，OA軟骨細胞較正常軟骨細胞更高表達P53和P53AIP-1，而P53和P53AIP-1下調(diào)

則可能抑制OA軟骨細胞凋亡。

3.2 Bcl-2基因家族 Bcl-2是B細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2）的縮寫。迄今發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族成員至少有25個。按結(jié)構(gòu)功能不同Bcl-2家族分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。促凋亡蛋白主要有Bax、Bak、Bad、Bik等；抗凋亡蛋白主要有Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等。研究[12]認為，Bcl-2家族主要定位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等部位，通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，影響膜電位及細胞色素C釋放，以及調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)Ca2+濃度來促進或抑制細胞凋亡。

Bcl-2基因位于18號染色體，具有抑制細胞凋亡和延長細胞壽命的功能[13]。Erlacher等[14]發(fā)現(xiàn)，OA患者關(guān)節(jié)軟骨Bcl-2 mRNA表達較正常者高，在軟骨缺損區(qū)周圍其表達水平更高，提示機體通過上調(diào)Bcl-2水平來保護軟骨細胞免遭凋亡。Bax基因位于11號染色體，具有誘導(dǎo)細胞凋亡的功能，在OA軟骨細胞凋亡的過程中，表達升高。

Bcl-2家族均含有一種以上共有的同源結(jié)構(gòu)域（Bcl-2 homology，BH），分別為BH1、BH2、BH3、BH4。其家族成員可借此形成同源或異源性二聚體。軟骨細胞的存活與否和二聚體之間的平衡相關(guān)。Bax過量，形成Bax二聚體，細胞趨于凋亡；Bcl-2過量，形成Bcl-2二聚體，細胞趨于存活。另外，Bax和Bcl-2也能形成二聚體，Bax/Bcl-2比值升高則抑制細胞凋亡，反之則促進細胞凋亡。所以Bcl-2和Bax共同調(diào)節(jié)了軟骨細胞的凋亡[15]。

3.3 c-myc基因 c-myc基因位于8號染色體，表達為由439個氨基酸組成的蛋白。c-myc只在凋亡細胞中有散在表達。Yatsugi等[16]研究認為，c-myc參與了OA患者軟骨細胞凋亡的全過程。細胞生長受到抑制時，c-myc陽性的增生信號和陰性生長抑制信號不成比例表達，導(dǎo)致細胞凋亡。但也有研究認為c-myc的主要作用是參與轉(zhuǎn)錄。根據(jù)其蛋白分子構(gòu)象中誘導(dǎo)增殖或誘導(dǎo)凋亡的活性區(qū)域重疊不同，既可以誘導(dǎo)細胞分化，也可以阻止細胞分化導(dǎo)致凋亡[17]。

3.4 ICE基因家族 ICE基因表達為IL-1β轉(zhuǎn)化酶（interleukin-1βconverting enzyme，ICE），是一種與ced-3同源的蛋白分子。這種蛋白分子均被稱為半胱天冬氨酸蛋白酶（cysteine containing aspartate specific protease，caspase）。因此ICE家族多被稱為caspases家族。caspases家族成員多以30-50kD的單一多肽酶形式存在于細胞內(nèi)。它的活化可激活DNA內(nèi)切酶，最終導(dǎo)致DNA片段化和凋亡發(fā)生。按被發(fā)現(xiàn)的先后順序，ICE即為caspase-1。目前已發(fā)現(xiàn)的caspases至少有14種[18]，按作用不同分為三類：調(diào)控型，參與細胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)（caspase-1、4、5、11、12、13、14）；啟動型，啟動細胞級聯(lián)凋亡反應(yīng)（cas?pase-2、8、9、10）；執(zhí)行型，細胞凋亡的直接效應(yīng)者（caspase-3、6、7）。caspase-3是新近予以關(guān)注的cas?pases家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，可作為細胞凋亡事件發(fā)生的分子標(biāo)志之一[19]。研究[20]發(fā)現(xiàn)，cas?pase-3在OA患者的軟骨中大面積分布。因此，不少新的科研將抗凋亡藥物的研發(fā)定位于caspase-3抑制劑[21]。葉春婷等[22]利用病毒載體把caspase-3 siR?NA轉(zhuǎn)入軟骨細胞，使軟骨細胞caspase-3基因沉默，達到拮抗軟骨細胞凋亡的目的。

4 中醫(yī)藥治療

OA屬中醫(yī)“痹癥”、“骨痹”等范疇。其病機主要是正氣不足，肝腎虧虛，感受風(fēng)、寒、濕邪，氣血瘀滯，臨床上多從益氣養(yǎng)血、補益肝腎、活血化瘀、祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒等方面對OA辨證論治。中醫(yī)藥在治療OA的療效是肯定的。近年來，國內(nèi)學(xué)者運用細胞學(xué)、分子生物學(xué)、病理組織學(xué)等多種手段從微觀角度對中醫(yī)藥治療OA的機理進行闡釋，認為中醫(yī)藥治療OA作用途徑包括：①促進軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞凋亡；②改善退變過程中軟骨組成及代謝；③改善骨內(nèi)微循環(huán)障礙；④抑制NO的合成；⑤調(diào)節(jié)細胞因子。

對于中醫(yī)藥與軟骨細胞凋亡基因之間關(guān)系的研究，是當(dāng)前的一個熱門話題。李楠等[23]研究發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠可引起硝普鈉誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡后Bcl-2表達升高及Bax下降，從而有效阻斷軟骨細胞凋亡，達到延緩OA發(fā)病過程的作用。周達岸等[24]研究認為，骨痹消可通過上調(diào)Bcl-2、下調(diào)P53表達，以保護軟骨細胞，兩者共同參與了軟骨細胞凋亡的調(diào)節(jié)。馮俊奇等[25]認為，舒筋止痛液配合離子導(dǎo)入對骨關(guān)節(jié)炎具有較強的抗炎鎮(zhèn)痛作用，可抑制軟骨細胞凋亡進程，提高相關(guān)基因表達水平。戴七一等[26]研究發(fā)現(xiàn)運用揉髕手法可以明顯降低兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡率，其作用機制與上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax、Fas表達有關(guān)。

5 結(jié)語

目前在臨床治療上仍然沒能找到一種特別有效、能徹底治愈OA的方法。隨著新的軟骨細胞凋亡基因和凋亡途徑不斷地被發(fā)現(xiàn)，探尋凋亡基因調(diào)控與OA發(fā)病之間的確切關(guān)系，運用中西醫(yī)結(jié)合的治療方案，獲求基因治療的靶點，為更有效的防治OA提供合理的策略，或?qū)⒊蔀榻窈蟮难芯糠较颉?/p>

［1］Koopman WJ，Moreland LW.Arthritis and Allied Conditions（15rd）［M］.天津:天津科技翻譯出版社，2010:2018-2020.

［2］Moskowitz RW，Howell DS，Altman RD，et al.Osteoarthritis Diagnosis and Medical/Surgical Management（3rd）［M］.天津:天津科技翻譯出版社，2005:109-110.

［3］Palmieri B，Lodi D，Capone S.Osteoarthritis and degenera?tive joint disease:local treatment options update［J］.Acta Biomed，2010，81（2）:94-100.

［4］TaniguchiN，Caramés B，Ronfani L，etal.Aging-related loss of the chromatin protein HMGB2 in articular cartilage is linked to reduced cellularity and osteoarthritis［J］.Proc Natl Acad SciUSA，2009，106（4）:1181-1186.

［5］Johnson EO，Charchandi A，Babis GC，etal.Apoptosis in os?teoarthritis:morphology，mechanisms，and potential means for therapeutic intervention［J］.JSurg Orthop Adv，2008，17（3）:147-152.

［6］Kawaguehi H.Endochondral ossification signals in cartilage degradation during osteoarthritis progression in experimen?talmousemodels［J］.MolCells，2008，25（1）:1-6.

［7］Saito S，Murakoshi K，Kotake S，et al.Granzyme B induces apoptosis of chondrocytes with natural killer cell-like cyto?toxicity in rheumatoid arthritis［J］.J Rheumatol，2008，35（10）:1932-1943.

［8］Hashimoto S，Setareh M，Ochs RL，et al.Fas/Fas ligand ex?pression and induction of apoptosis in chondrocytes［J］.Ar?thritisRheum，1997，40（10）:1749-1755.

［9］楊昕，曹永平，文立成，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對軟骨細胞影響的研究進［J］.中國矯形外科雜志，2009，17（9）:671-673.

［10］Ryu JH，Shin Y，Huh YH，et al.Hypoxia-inducible fac?tor-2αregulates Fas-mediated chondrocyte apoptosis dur?ing osteoarthritic cartilage destruction［J］.Cell Death Dif?fer，2012，19（3）:440-450.

［11］Hashimoto S，Nishiyama T，Hayashi S，etal.Role of P53 in human chondrocyte apoptosis in response to shear strain［J］.ArthritisRheum，2009，60（8）:2340-2349.

［12］Tang Y，Zhang DY，Wu XM.Progress in small-molecule in?hibitors of Bcl-2 family proteins［J］.Yao Xue Xue Bao，2008，43（7）:669-677.

［13］Oshima Y，Akiyama T，Hikita A，etal.Pivotal role of Bcl-2 family proteins in the regulation of chondrocyte apoptosis［J］.JBiolChem，2008，283（39）:26499-26508．

［14］Erlacher L，Maier R，Ullrich R，etal.Differentialexpression of the protomeo gene Bcl-2 in normaland osteoarthritishu?man articular cartilage［J］.Rheum，2004，22:926-931.

［15］吳追樂，李西海，吳廣文，等.透骨消痛膠囊含藥血清對軟骨細胞線粒體凋亡通路的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（2）:343-346.

［16］YatsugiN，Tsukazaki T，OsakiM，etal.Apoptosis of articu?lar chondrocytes in rheumatoid arthritis and osteoarthritis: correlation of apoptosiswith degree of cartilage destruction and expression of apoptosis-related proteins of P53 and c-myc［J］.JOrthop Sci，2000，5（2）:150-156.

［17］Ohmori Y，Tanabe J，Takada S，et al.Functional domainsof c-myc involved in the comnitment and differentiation of murine erythroleukemia cell［J］.Oneogene，1993，8（2）: 379-386.

［18］江雨霏，沈波.caspase基因與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性的關(guān)系［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，40（2）:125-127.

［19］Kliem H，Berisha B，Meyer HH，etal.Regulatory changes of apoptotic factors in the bovine corpus luteum after induced luteolysis［J］.MolReprod Dev，2009，76（3）:220-230.

［20］Zhao H，Qiu GX，Guan J，et al.Correlation of apoptosis of articular chondrocytes in osteoarthritiswith degree of carti?lage destruction and expression of apoptosis-related pro?teins:surviving，caspase-3，and Bcl-xl［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88（19）:1339-1341.

［21］Du JQ，Wu J，Zhang HJ，et al.Isoquinoline-1，3，4-trione derivatives inactivate caspase-3 by generation of reactive oxygen species［J］.JBiol Chem，2008，283（44）:30205-30215.

［22］葉春婷，黃耀熊，楊小紅.caspase-3 siRNA抑制關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（50）:9833-9836.

［23］李楠，雒煥生，尹玉彪，等.龜鹿二仙膠及其拆方含藥血清對硝普鈉誘導(dǎo)的大鼠軟骨細胞Bax、Bcl-2表達的影響［J］.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2012，20（1）:1-3.

［24］周達岸，鄭洪新，李靜.骨痹消對兔骨性膝關(guān)節(jié)炎軟骨細胞P53、Bcl-2表達的影響［J］.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2010，19（5）:494-497.

［25］馮俊奇，孫超，孫軍強，等.藥透治療對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡和相關(guān)基因表達的影響［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2009，34（2）:186-188.

［26］戴七一，阮萍，崔偉，等.揉髕手法對兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡及Bcl-2、Bax和Fas表達的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（46）:8556-8559.

2012-11-08

浙江省教育廳高?？蒲谢痦椖浚∟o.20071135）

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