徐瓅 張朝然

熱休克反應(yīng)是細(xì)胞對于應(yīng)激及損傷的一種反應(yīng)。在熱休克反應(yīng)中，熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)的表達(dá)上調(diào)使得細(xì)胞免于死亡。角膜創(chuàng)傷修復(fù)是一個極其復(fù)雜的過程，目前仍不完全清楚其機(jī)制。由于熱休克反應(yīng)及HSP的表達(dá)對于角膜創(chuàng)傷修復(fù)有著重要的作用，因此，HSP的表達(dá)調(diào)控已成為研究角膜創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制以及調(diào)控該過程的一個熱點(diǎn)。

本文就HSP的表達(dá)調(diào)控及其對角膜創(chuàng)傷修復(fù)作用的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 熱休克反應(yīng)、HSP及其生物學(xué)作用

在正常情況下，HSP在細(xì)胞中就有表達(dá)［1］。在感染、毒物、創(chuàng)傷、缺氧、失水等應(yīng)激狀態(tài)下，HSP的表達(dá)均可上調(diào)［1］。此時，正因?yàn)镠SP的表達(dá)上調(diào)，抑制了半胱天冬酶(caspase)的活化，使得細(xì)胞免于死亡。因此，當(dāng)細(xì)胞無法產(chǎn)生HSP時，它們將會凋亡。

我們通常所說的 HSP60、HSP70、HSP90分別是大小為60×103、70×103和90×103的HSP。其中，HSP27和HSP90抑制Apaf-1的釋放及其與細(xì)胞色素 c的結(jié)合，從而抑制了caspase 9的活化［2-3］。HSP10和HSP60在線粒體中表達(dá)，并與procaspase 3和6結(jié)合，使procaspase 3和6仍然保持它們的蛋白質(zhì)水解能力，從而抑制凋亡［4］。此外，HSP還有分子伴侶的作用，對于蛋白之間的相互作用、蛋白折疊及其合成代謝，并在蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要的作用［1，5］。部分HSP也被認(rèn)為可通過識別細(xì)胞表面的特定蛋白來幫助免疫系統(tǒng)識別患病細(xì)胞［6］。

2 調(diào)控HSP表達(dá)的因素

研究表明，有很多因素或物質(zhì)可影響及調(diào)控HSP的表達(dá)，例如感染、創(chuàng)傷、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子伴侶化合物等。

HSP對于應(yīng)激所作出的反應(yīng)是通過各條信號通路的活化來實(shí)現(xiàn)的。由于MAPK——一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛分布在眼部各種組織中，所以P38MAPK通路是眼部組織中HSP表達(dá)調(diào)控的一條重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在應(yīng)激狀態(tài)下，MAPK被激活，之后通過此通路使HSP27磷酸化，從而上調(diào)其表達(dá)。Ono等［7］早在2000年已證明P38MAPK激活與炎癥和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)。Meng等［8］的研究表明，P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與損傷組織中HSP27的表達(dá)調(diào)控。

近年來，分子伴侶化合物調(diào)控HSP表達(dá)，緩解細(xì)胞應(yīng)激，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡的作用被越來越多地報道，并已成為研究熱點(diǎn)。

分子伴侶化合物是一種具有伴侶活性的外源性小分子物質(zhì)，包括苯基丁酸鈉(sodium 4-phenylbutyrate，NaPB)、三氧化甲胺(trimethylamine N-oxide，TMAO)、二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)等。它們可糾正多種錯誤折疊的蛋白，以及這些蛋白折疊異常所導(dǎo)致的細(xì)胞缺陷。正因?yàn)榉肿影閭H化合物具有糾正及穩(wěn)定蛋白折疊的功能，它們可以緩解細(xì)胞的應(yīng)激，從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。

2009年，Chamcheu等［9］報道 TMAO 可減少角蛋白(keratin)突變的原代集落心肌(EBS)細(xì)胞中角蛋白的聚集。2011年2月，他們發(fā)現(xiàn)TMAO和NaPB都可通過調(diào)控HSP70的表達(dá)來影響突變的 keratin表達(dá)［10］;同年8月，Chamcheu等［11］研究再次證實(shí)了這兩項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)即使EBS細(xì)胞不處于應(yīng)激狀態(tài)，TMAO也可使其HSP70的表達(dá)上調(diào)，而且HSP70的表達(dá)上調(diào)可在細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)的時候繼續(xù)保持，但HSP90的表達(dá)并無大幅度的變化，進(jìn)一步提示TMAO通過上調(diào)HSP的表達(dá)減少突變蛋白的聚集，從而減輕應(yīng)激，防止細(xì)胞凋亡。2011年，Suaud等［12］報道NaPB可通過Elp2以及STAT-3信號通路刺激人囊性纖維化肺上皮(IB3-1)細(xì)胞中HSP70的表達(dá)，提示NaPB可能通過上調(diào)HSP70的表達(dá)，促進(jìn)ΔF508突變的囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)基因(cystic fibrosis transmembrane regulator，CFTR)的轉(zhuǎn)運(yùn)。2012年1月，也有研究［13］表明NaPB可通過刺激HSP70的表達(dá)糾正THP突變，從而減輕應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡。

在眼科研究中，分子伴侶化合物也通過調(diào)控HSP的表達(dá)顯現(xiàn)了其糾正蛋白折疊及挽救細(xì)胞的功能。例如，在myocilin(MYOC)突變引起的原發(fā)性開角型青光眼的細(xì)胞模型中，1 mmol/L的NaPB還可減少M(fèi)YOC在人小梁網(wǎng)細(xì)胞內(nèi)的積聚，提高人小梁網(wǎng)細(xì)胞中HSP的表達(dá)，緩解細(xì)胞應(yīng)激，從而提高人小梁網(wǎng)細(xì)胞的生存率［14-15］。在先天性白內(nèi)障的研究中，TMAO減少G98R突變αA晶體蛋白(αA-crystallin)在晶狀體上皮細(xì)胞中的積聚，使晶狀體上皮細(xì)胞中HSP的表達(dá)上調(diào)，從而緩解細(xì)胞應(yīng)激，NaPB糾正G165fsX8突變的γD晶體蛋白(γD-crystallin)的錯義突變，從而抑制晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡［16-17］。

3 HSP表達(dá)對角膜創(chuàng)傷修復(fù)作用的研究進(jìn)展

HSP的表達(dá)水平與皮膚創(chuàng)傷修復(fù)密切相關(guān)，在修復(fù)良好的傷口中，HSP呈高表達(dá);反之，在修復(fù)不良的傷口中低表達(dá)或無表達(dá)［18］。在角膜創(chuàng)傷修復(fù)的過程中，HSP的表達(dá)上調(diào)也是細(xì)胞自身修復(fù)的一部分。

早在20世紀(jì)90年代，就有了圓錐角膜的創(chuàng)傷修復(fù)中HSP表達(dá)的研究。該研究［19］表明，在圓錐角膜及人工晶狀體眼的大皰性角膜病變的角膜中，HSP的表達(dá)高于正常角膜，提示了HSP在角膜損傷及疾病中的作用。

進(jìn)入21世紀(jì)，各種HSP在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中的作用被進(jìn)一步證實(shí)，其中，HSP70更是近幾年的一個研究熱點(diǎn)。

3.1 小分子HSP表達(dá)對角膜創(chuàng)傷修復(fù)的作用 小分子HSP中，HSP47和HSP27對角膜創(chuàng)傷修復(fù)的作用已被證實(shí)。

2003年，Miyamoto對新西蘭白兔進(jìn)行準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)(photorefractive keratectomy，PRK)，術(shù)后 3 d，在角膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)層即可檢測到HSP47的表達(dá)，但在角膜基質(zhì)及內(nèi)皮中檢測不到。術(shù)后5～7 d，HSP47的表達(dá)范圍擴(kuò)展到基質(zhì)深層以及角膜內(nèi)皮;28 d后逐漸減少，提示HSP47除了在應(yīng)激時保護(hù)角膜細(xì)胞，更作為膠原蛋白肽的分子伴侶發(fā)揮作用，加快PRK后角膜前基質(zhì)細(xì)胞中膠原蛋白的合成，從而導(dǎo)致角膜基質(zhì)混濁［20］。之后，HSP47對角膜的保護(hù)作用被進(jìn)一步證實(shí)。2004年，Kim等［21］發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HSP47的表達(dá)可保護(hù)角膜免受熱損傷，并且對于加快角膜創(chuàng)傷修復(fù)以及準(zhǔn)分子激光術(shù)后減輕角膜和晶狀體的混濁有著重要的作用。

近幾年來，HSP27的表達(dá)變化也被證實(shí)對角膜創(chuàng)傷修復(fù)的過程起到重要的作用。2006年2月，Shi等［22］發(fā)現(xiàn)在角膜上皮細(xì)胞暴露于B波紫外線(UVB)之前加入亞硝酸鹽可提高角膜上皮細(xì)胞中HSP27的表達(dá)并促進(jìn)其磷酸化，從而減少UVB引起的細(xì)胞死亡，及其引起的capases的活化及DNA斷裂。在細(xì)胞中加入可通過抑制p38MAPK活化來抑制HSP27磷酸化的SB203580之后，亞硝酸鹽減少UVB引起細(xì)胞死亡的作用被部分逆轉(zhuǎn)。同年9月，他們進(jìn)一步證實(shí)了在正常角膜細(xì)胞中，HSP27是以非磷酸化形式存在的，UVB照射后，HSP27迅速磷酸化，提示這種應(yīng)激反應(yīng)與HSP27對角膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用相關(guān)［23］。2012年7 月，Jain等［24］發(fā)現(xiàn)正常角膜中，磷酸化的HSP27表達(dá)只是局限于上皮表面;而當(dāng)角膜上皮損傷8 h后，它的表達(dá)在角膜上皮前緣達(dá)到高峰;3 d后在角膜上皮表面及基底層都有表達(dá)，并且高于正常角膜;損傷7～14 d后，磷酸化HSP27的表達(dá)回落到正常水平，并再次局限于角膜上皮表面。該結(jié)果提示，在角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程中，HSP27的磷酸化及表達(dá)變化在細(xì)胞遷移及結(jié)構(gòu)重組的過程中起到至關(guān)重要的作用。

3.2 HSP70表達(dá)對角膜創(chuàng)傷修復(fù)的作用 HSP70在近10年都是研究的熱點(diǎn)，也使HSP對角膜創(chuàng)傷修復(fù)的作用被進(jìn)一步證實(shí)。

2004年，Kim等［25］研究表明，HSP70的表達(dá)水平取決于細(xì)胞熱應(yīng)激后的恢復(fù)時間。在熱應(yīng)激6 h后，HSP70的表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞的生存率也明顯提高，從而證實(shí)了HSP70的表達(dá)提高具有在氧化應(yīng)激狀態(tài)下保護(hù)人角膜成纖維細(xì)胞的作用，其機(jī)制可能為HSP70減輕DNA修復(fù)酶的聚合作用，從而防止一氧化氮(NO)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ATP水平的下降。同年，Miya等［26］也證實(shí)了角膜激光切削術(shù)后角膜基質(zhì)中HSP70表達(dá)的上調(diào)及其對角膜的保護(hù)作用。

近幾年來，也陸續(xù)有研究證實(shí)了HSP在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中的重要作用。2008年，Ko等［27］研究探索了纖連蛋白獲得性多肽PHSRN對角膜上皮遷移的作用及其對人角膜上皮細(xì)胞中HSP70表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，PHSRN可以使人角膜上皮細(xì)胞中HSP70的表達(dá)上調(diào)，并且，PHSRN引起的HSP70表達(dá)的上調(diào)可被SB203580阻斷。因此，此項(xiàng)研究提示，誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)可提升PHSRN對角膜上皮遷移的促進(jìn)作用，從而促進(jìn)角膜上皮修復(fù)。Mushtaq等［28］于2007年研究了在細(xì)胞遷移的不同階段中HSP70的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在角膜上皮細(xì)胞遷移活躍階段(角膜上皮損傷48 h內(nèi))，HSP70的表達(dá)明顯增加。該結(jié)果提示HSP70可作為分子伴侶調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移及角膜上皮增殖，從而起到保護(hù)角膜的作用。2011年，他們又發(fā)現(xiàn)局部10 μg/mL的HSP70抗體可使角膜上皮修復(fù)緩慢，從而再次證實(shí)了HSP70在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中的重要作用［29］。同年，國內(nèi)也有研究［30］證實(shí)了在角膜針刺損傷后1天內(nèi)，大鼠角膜HSP70的表達(dá)水平顯著升高，其后逐漸下降，也提示了HSP70是參與角膜創(chuàng)傷愈合的重要分子。2012年，Ma等［31］對人角膜緣上皮細(xì)胞的研究表明，將細(xì)胞種植在羊膜上可使HSP70超表達(dá)，而HSP70的高表達(dá)可在UVB及過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的條件下提高其生存率?？梢?，HSP70在角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)的過程中也起到非常重要的作用。

3.3 其他HSP表達(dá)對角膜創(chuàng)傷修復(fù)的作用 除了之前提到的小分子HSP以及HSP70，其他HSP對角膜創(chuàng)傷修復(fù)的作用也在近幾年有所報道。

2010年，Ebrahimi等［32］研究發(fā)現(xiàn)，羊膜可以為原代人角膜緣干細(xì)胞在體外的增殖及其表型的維持提供良好的環(huán)境，并發(fā)現(xiàn)將細(xì)胞暴露在空氣中后，種植在羊膜上的細(xì)胞HSP90的表達(dá)高于種植在培養(yǎng)皿上的細(xì)胞，提示羊膜可通過上調(diào)HSP90的表達(dá)起到在應(yīng)激中保護(hù)細(xì)胞的作用?？梢?，各種HSP在角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)的過程中均起到非常重要的作用。

4 展望

綜上所述，HSP是一類具有分子伴侶作用的蛋白質(zhì)，在應(yīng)激狀態(tài)時，它的表達(dá)水平對于細(xì)胞的生存起著重要的作用，調(diào)控其表達(dá)在角膜創(chuàng)傷修復(fù)的過程中亦至關(guān)重要。在影響HSP表達(dá)的因素中，分子伴侶化合物是較為重要的因素，此類物質(zhì)可通過減輕細(xì)胞應(yīng)激或提高HSP的表達(dá)起到減少細(xì)胞凋亡及保護(hù)細(xì)胞的作用，但尚未見其對角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)作用的報道。因此，全面深入的研究角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)和探究更多促進(jìn)角膜上皮創(chuàng)傷修復(fù)的物質(zhì)和手段，造福患者將是我們所面臨的重大課題之一。

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