徐慶 武靜 李貞

引起白內(nèi)障術(shù)后發(fā)生后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO)的因素有很多，包括手術(shù)創(chuàng)傷、炎癥介質(zhì)釋放、血房水屏障破壞、晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)和皮質(zhì)殘留、人工晶狀體的材料、設(shè)計(jì)及植入位置等［1］。對(duì)PCO發(fā)生機(jī)制的研究［2］結(jié)果表明，殘留的 LECs增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生是引發(fā)PCO的主要原因。迄今為止，誘導(dǎo)發(fā)生上述過(guò)程的信號(hào)因子尚不明確，但在離體PCO模型的研究中發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，多種調(diào)控因子參與了PCO的發(fā)生過(guò)程，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等，其中TGF-β在此過(guò)程起著至關(guān)重要的作用［3-4］。本研究在體外培養(yǎng)的LECs 中，加入100 pg/mL濃度的TGF-β2，誘導(dǎo)其發(fā)生EMT，觀察轉(zhuǎn)分化的人LECs在形態(tài)和基因表型上發(fā)生的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 MTT試劑盒購(gòu)于碧云天公司(中國(guó));TGF-β2、人LECs購(gòu)于ATCC公司(美國(guó));Trizol試劑、SYBR Green I染料、Platinum Taq DNA聚合酶、SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶等購(gòu)于 Invitrogen公司(美國(guó));αB-晶狀體蛋白抗體購(gòu)于Chemicon公司(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行人LECs常規(guī)傳代培養(yǎng)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中αB-晶狀體蛋白表達(dá)，主要步驟:磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)漂洗蓋玻片上培養(yǎng)的人LECs，室溫晾干、丙醛浸泡20 min，PBS漂洗;37℃下用3%H2O2孵育10 min，PBS漂洗;羊血清37℃封閉10 min，加抗人αB-晶狀體蛋白抗體，37℃孵育1 h(以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照);加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗;加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素，37℃孵育30 min，PBS漂洗;DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗;蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，光學(xué)顯微鏡(簡(jiǎn)稱光鏡)下觀察。

1.2.2 噻唑藍(lán)法［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］在96孔板中每孔加入100 μL 2000 個(gè)人LECs，不同濃度的 TGF-β2(0、1、3.3、10、33、100、330 pg/mL)處理組各設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，均處理0、6、24、48 h。每孔加入 20 μL MTT 溶液。在 CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值(OD值)。以0 pg/mL濃度TGF-β2處理組為對(duì)照組，其余各濃度組的測(cè)量值為各時(shí)間點(diǎn)3個(gè)復(fù)孔OD值的均數(shù)。分別將各濃度組48 h和0 h OD值的均數(shù)差與對(duì)照組做組間單因素方差分析，并換算成抑制率，選出最佳TGF-β2處理濃度。

1.2.3 最佳濃度TGF-β2處理后對(duì)人LECs形態(tài)學(xué)影響 倒置顯微鏡觀察及拍攝用最佳濃度TGF-β2處理0、6、24、48 h 后的人 LECs照片。

1.2.4 熒光定量RT-PCR法檢測(cè)mRNA的表達(dá) 從經(jīng)濃度為100 pg/mL 的 TGF-β2 處理 0、6、24、48 h 的人 LECs及空白對(duì)照組0、6、24、48 h的人 LECs中抽提RNA。消化離心收集2×106人LECs，用Trizol一步法提取各樣品組的總RNA;每組取4 μg總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)，反 應(yīng) 體 系:總 RNA 5 μL，oligo dT 引 物(50 μmol/L)0.5 μL，隨機(jī)引物 0.5 μL，10 mmol/L dNTP 混合液1 μL，DEPC 處理水5 μL，配置得到12 μL混合液Ⅰ，再在混合液Ⅰ的反應(yīng)體系內(nèi)加5倍的第一鏈緩沖液 4 μL，0.1 mol/L dTT 2 μL，RNA 酶 抑 制 劑(40 U/μL)1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ(200 U/μL)1 μL，混合液I 12 μL配置得到20 μL混合液Ⅱ。反應(yīng)條件:25℃處理5 min，50℃處理60 min，70℃處理15 min。立即放置到冰上。得到 cDNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后，取2 μL DNA產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量 PCR。PCR體系:雙蒸水12.3 μL，10 倍的 PCR 緩沖液 2 μL，50 mmol/L 的 Mg2+溶液2 μL，10 mmol/L 的 dNTPs 溶液 0.5 μL，20 倍的sybgreen 染料 1 μL，10 μmol/L 的下游引物 0.5 μL，5 U/μL的 Taq 酶 0.2 μL，混合液Ⅱ1 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 2 min，變性95℃ 10 s，退火60℃ 30 s，延伸70℃ 45 s，反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。分別檢測(cè)E-鈣粘蛋白(E-cadherin，CDH1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(vimentin，VIM)的 Ct值，并換算成△Ct均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)表達(dá)量(2-△Ct)。各基因的引物序列見(jiàn)表1。對(duì)照組為actin內(nèi)參基因。

表1 各基因的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差以及相對(duì)表達(dá)量表示，所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)。經(jīng)單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法選擇TGF-β2最佳濃度 用不同濃度的TGF-β2(0、1、3.3、10、33、100、330 pg/mL)，分別處理人 LECs 0、6、24、48 h，經(jīng) MTT 反應(yīng)后，測(cè)定 490 nm 處的OD值(表2、圖1)。結(jié)果顯示:100 pg/mL的TGF-β2對(duì)人LECs的增殖抑制最為明顯，抑制率為36.9%，P=0.001(表3)，故選擇該濃度作為本實(shí)驗(yàn)的TGF-β2最佳處理濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 結(jié)果顯示，光鏡下見(jiàn)傳代培養(yǎng)人LECs呈多邊形上皮樣細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)(圖2)。用免疫組織化學(xué)方法染色見(jiàn)αB-晶狀體蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞中大量表達(dá)，表達(dá)部位為胞質(zhì)，證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為人LECs(圖3)。

表2 MTT反應(yīng)后各時(shí)間點(diǎn)3次測(cè)定不同濃度TGF-β2處理人LECs的OD值

圖1.細(xì)胞活性折線圖

表3 不同濃度TGF-β2處理人LECs 48 h后對(duì)其增殖的影響

圖2.培養(yǎng)人LECs呈多邊形上皮樣細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)

2.3 TGF-β2處理人LECs后對(duì)其形態(tài)學(xué)的影響 用100 pg/mL 濃度的 TGF-β2 處理人LECs 6、24、48 h 后，細(xì)胞形態(tài)上拉長(zhǎng)，呈梭形，表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞樣外觀(圖4)。

圖3.光鏡下觀察αB-晶狀體蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性，表達(dá)部位為胞質(zhì)(×100)

2.4 TGF-β2對(duì)人LECs發(fā)生EMT時(shí)相關(guān)基因表達(dá)的影響 從經(jīng)濃度為100 pg/mL的 TGF-β2處理0、6、24、48 h 的人 LECs及空白對(duì)照組 0、6、24、48 h 的人LECs中抽提 RNA，反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR檢測(cè)表示，CDH1、α-SMA、VIM以及對(duì)照組actin內(nèi)參基因表達(dá)水平的Ct值。

2.4.1 CDH1 結(jié)果表明，100 pg/mL TGF-β2 處理人LECs后，隨著時(shí)間的推移，CDH1相對(duì)表達(dá)量逐漸下調(diào)，48h時(shí)達(dá) 1.10E-06。和對(duì)照組 2.68E-06 相比，表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)(表4、圖5)。

2.4.2 α-SMA 結(jié)果表明，100 pg/mL TGF-β2 處理人LECs后，隨著時(shí)間的推移，α-SMA相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，48 h時(shí)達(dá)9.21E-03。雖和對(duì)照組8.67E-03相比，表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.551)，但仍呈上升趨勢(shì)(表5、圖 6)。

圖4.100 pg/mL濃度TGF-β2處理6、24、48 h后的人LECs形態(tài)照片 A:處理6 h后;B:處理24 h后;C:處理48 h后

表4 100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的CDH1 Ct值、△Ct均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差以及相對(duì)表達(dá)量

表5 100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的α-SMA Ct值、△Ct均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差以及相對(duì)表達(dá)量

圖5.100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的CDH1相對(duì)表達(dá)量曲線圖

2.4.3 VIM 結(jié)果表明，100 pg/mL TGF-β2 處理人LECs后，隨著時(shí)間的推移，VIM相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，48 h時(shí)達(dá)1.64E-02和對(duì)照組1.37E-02相比，表達(dá)水平有顯著差異(P=0.006)(表6、圖7)。

圖6.100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的α-SMA相對(duì)表達(dá)量曲線圖

表6 100pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的VIM Ct值、△Ct均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差以及相對(duì)表達(dá)量

圖7.100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的VIM相對(duì)表達(dá)量曲線圖

3 討論

目前認(rèn)為，PCO主要是一個(gè)由多因子參與調(diào)控的、殘留的LECs發(fā)生EMT的過(guò)程。屆時(shí)，上皮源性的LECs在某種特定的條件下，進(jìn)行一系列的轉(zhuǎn)錄和蛋白修飾，使其特有的上皮細(xì)胞表型表達(dá)受阻遏，如CDH1等表達(dá)下降;轉(zhuǎn)而分化為表達(dá)間質(zhì)源性細(xì)胞特有表型的間質(zhì)細(xì)胞，如VIM、α-SMA等標(biāo)志性抗原的表達(dá)上調(diào)，這使得LECs之間發(fā)生分離，失去頂-基極性和移動(dòng)性增強(qiáng)，從而發(fā)生變形、增殖和遷移［5-7］。

Yang等［8］運(yùn)用培養(yǎng)腎血管上皮細(xì)胞做模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在TGF-β1誘導(dǎo)下，腎血管上皮細(xì)胞發(fā)生的整個(gè)EMT過(guò)程需完成4個(gè)關(guān)鍵步驟，分別是:上皮細(xì)胞失去原有的黏著特性，上皮細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的α-SMA和出現(xiàn)肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)重構(gòu)，基底膜瓦解，轉(zhuǎn)分化的上皮細(xì)胞增強(qiáng)了遷移和侵襲能力。

EMT的觸發(fā)和進(jìn)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，可能由各種調(diào)控因子(如TGF-β、FGF、EGF和PDGF等)經(jīng)細(xì)胞表面的絲-蘇氨酸或酪氨酸蛋白激酶受體作用，通過(guò)多個(gè)互相之間存在有意義串并的路徑(包括Wnt、Notch信號(hào)通路)，最后激活上皮細(xì)胞基因表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄程序而發(fā)動(dòng)的［6-8］。其中TGF-β在此過(guò)程中是最主要的因子。正常情況下TGF-β在人的房水、玻璃體和晶狀體中均有表達(dá)，以TGF-β2為主，且多以無(wú)活性的潛伏型存在，活化后對(duì)LECs的生理性分化起著至關(guān)重要的作用。TGF-β 3種同源異構(gòu)體均可誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT，而TGF-β2是效價(jià)最高的一個(gè)亞型，比 TGF-β1 強(qiáng)10 倍以上［9-11］

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到，在體外培養(yǎng)的人LECs中，加入濃度為100 pg/mL的TGF-β2后，人LECs在形態(tài)上拉長(zhǎng)，呈梭形(圖4)。采用qRt-PCR檢測(cè)其CDH1、α-SMA、VIM等相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人LECs出現(xiàn)了間質(zhì)細(xì)胞的表型，即上皮細(xì)胞標(biāo)志性基因CDH1相對(duì)表達(dá)量24 h后逐漸出現(xiàn)下調(diào)，并隨著時(shí)間的推移越發(fā)明顯，48 h時(shí)為1.10E-06，和對(duì)照組2.68E-06相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)(表4、圖5)。同時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性基因VIM相對(duì)表達(dá)量24 h后逐漸上調(diào)，隨著時(shí)間的推移而明顯上升，48 h時(shí)達(dá)1.64E-02，和對(duì)照組1.37E-02 相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)(表6、圖7)。α-SMA的相對(duì)表達(dá)量雖然也逐漸上升，48 h時(shí)達(dá)9.21E-03，但和對(duì)照組8.67E-03相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.551)，然而48 h后α-SMA似仍有上升趨勢(shì)(表5、圖6)，當(dāng)然這還需做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)表明，在TGF-β2的誘導(dǎo)下，人LECs發(fā)生EMT后，其形態(tài)和基因表型均發(fā)生與間質(zhì)細(xì)胞相符的變化。

CDH家族是一種同親型結(jié)合、Ca2+依賴的上皮細(xì)胞跨膜黏著糖蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域與鄰近細(xì)胞所表達(dá)的CDH相互作用，在建立上皮細(xì)胞堅(jiān)固的黏著力，維持細(xì)胞極性和緊密性等方面起著關(guān)鍵作用［12］。不同的細(xì)胞及其不同的發(fā)育階段，所表達(dá)的CDH的種類與數(shù)量均有所不同。E-CDH位于上皮組織;N-CDH在神經(jīng)元中;P-CDH在胎盤中;T-CDH沒(méi)有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域且必須系鏈到質(zhì)膜上。E-CDH由胞外結(jié)構(gòu)域5個(gè)CDH重復(fù)(EC1～EC5)，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及一個(gè)結(jié)合p120連環(huán)素和β-連環(huán)素的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)高度磷酸化的區(qū)域，該區(qū)域?qū)ζ渑cβ-連環(huán)素的結(jié)合，繼而對(duì)于E-CDH的功能至關(guān)重要。上皮細(xì)胞中，含E-CDH的細(xì)胞間連接經(jīng)常毗鄰含肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架的微絲。CDH作為細(xì)胞黏附分子家族的一員，不僅維持著上皮細(xì)胞的黏附性，而且在細(xì)胞增殖和維持細(xì)胞極性方面也起著重要的作用［13］。CDH能夠抑制細(xì)胞間的分離，因此EMT的關(guān)鍵步驟就是下調(diào)CDH的作用［14］。E-CDH下調(diào)會(huì)降低組織內(nèi)細(xì)胞黏附的強(qiáng)度，導(dǎo)致細(xì)胞活動(dòng)性(motility)增加。

在EMT過(guò)程中，轉(zhuǎn)分化的上皮細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)以及α-SMA的表達(dá)能夠形成某種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，使得轉(zhuǎn)分化的上皮細(xì)胞不僅在形態(tài)學(xué)上成為間質(zhì)細(xì)胞［8］，而且能夠獲得遷移、侵襲甚至收縮的能力。而α-SMA是活化狀態(tài)的成纖維細(xì)胞的一種標(biāo)志物，實(shí)際上這些活化狀態(tài)的成纖維細(xì)胞也被稱為肌成纖維細(xì)胞［15］，它在形態(tài)及功能介于成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之間，擁有收縮及運(yùn)動(dòng)功能。

VIM是中間絲中的一種蛋白質(zhì)，它們與微管及肌動(dòng)蛋白微細(xì)絲共同組成細(xì)胞骨架。一個(gè)VIM單體有一個(gè)中央α螺旋結(jié)構(gòu)域，在前端連著一個(gè)非螺旋的氨基，末端連著一個(gè)羧基。兩個(gè)單體會(huì)互相扭曲，形成一個(gè)卷曲螺管形狀的二聚物。兩個(gè)二聚物會(huì)進(jìn)一步形成一個(gè)四聚物，再與其他四聚物相連成為一片。研究發(fā)現(xiàn)VIM附在細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體的旁邊或末端，因而相信它在支撐及錨固原生質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器起著重要的作用。它還能維持細(xì)胞的形狀、細(xì)胞質(zhì)的完整性及穩(wěn)定細(xì)胞骨架內(nèi)的相互作用。VIM的動(dòng)態(tài)特性對(duì)細(xì)胞的靈活性非常重要。在試管壓力測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，VIM能提供微管及肌動(dòng)蛋白所沒(méi)有的彈性，因此推測(cè)它負(fù)責(zé)維持細(xì)胞骨架的完整性。另外，沒(méi)有VIM的細(xì)胞受到微小的針刺時(shí)，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的傷害。在剔除VIM基因的實(shí)驗(yàn)老鼠中，雖然它們的動(dòng)能正常，但微管網(wǎng)卻因失去VIM而受損。這加強(qiáng)了微管與VIM之間存在緊密相互作用的假設(shè)。再者，當(dāng)微管解聚物出現(xiàn)時(shí)，VIM會(huì)發(fā)生重組，這表明了兩種系統(tǒng)之間存在內(nèi)在的聯(lián)系［16-17］。

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