韓竹梅 張興儒 柯梅青 倪振華 符之瑄 李青松 項(xiàng)敏泓

結(jié)膜松弛癥(conjunctivochalasis，CCh)是年齡相關(guān)性老年人常見(jiàn)眼?。?］，CCh的發(fā)病機(jī)制與球結(jié)膜成纖維細(xì)胞功能發(fā)生改變［2-3］，球結(jié)膜組織彈力纖維減少，膠原纖維融解［3-4］，球結(jié)膜厚度變?。?-6］，及球結(jié)膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達(dá)過(guò)強(qiáng)［7］，球結(jié)膜成纖維細(xì)胞MMPs與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)表達(dá)失衡有關(guān)［8］。MMPs 可降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，TIMPs是特異性MMPs抑制劑，二者共同維持ECM的合成及降解平衡。2012年1～12月通過(guò)檢測(cè)CCh球結(jié)膜成纖維細(xì)胞中MMPs及TIMPs的表達(dá)，旨在進(jìn)一步探討結(jié)膜松弛癥的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 CO2培養(yǎng)箱(SANYO公司，日本)，超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，倒置顯微鏡(WILOVERT公司，德國(guó))，低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))，酶標(biāo)檢測(cè)儀(BIO-RAD公司，美國(guó))，DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶溶液(上海博谷生物科技有限公司)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)添加物(FGS)(北京裕恒豐生物科技有限公司)。MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3 ELISA試劑盒(上海明睿生物有限公司)。收集上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院眼科手術(shù)室2012年1～12月病例資料。CCh組:隨機(jī)選擇CCh手術(shù)切除的松弛結(jié)膜13例(13眼)，按照Z(yǔ)hang［9］的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅱ級(jí)2眼，Ⅲ級(jí)8眼，Ⅳ級(jí)3眼，年齡54～82歲，平均(68.08±8.42)歲。正常對(duì)照組:為年齡配對(duì)的單純白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)的病例16例(16眼)，年齡56～85歲，平均(70.14±8.43)歲。均獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)［10］將切取的球結(jié)膜組織放入準(zhǔn)備好的無(wú)菌裝有9 g/L生理鹽水的一次性藥碗內(nèi)漂洗3次，除去血污;用眼科顯微剪刀將其剪成0.5～1 mm2大小組織塊，平鋪于六孔板內(nèi)，翻轉(zhuǎn)底朝上放置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察6孔板內(nèi)組織塊近干;翻轉(zhuǎn)6孔板底朝下，緩慢加入3 mL含10%體積胎牛血清和青霉素-鏈霉素、0.1%FGS的DMEM培養(yǎng)液，且勿使組織浮起，繼續(xù)培養(yǎng);每3天換液1次，在倒置相差顯微鏡下觀察接種組織塊貼壁及培養(yǎng)液情況。經(jīng)過(guò)倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)觀察及免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)成纖維細(xì)胞特異性蛋白的檢測(cè)，鑒定為成纖維細(xì)胞。

1.2.2 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清液中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3的質(zhì)量濃度 選取3～6代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將生長(zhǎng)至90%的細(xì)胞消化后，用含10%體積胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以2.5×105個(gè)/mL濃度接種于24孔板中，每孔為l mL。培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液，加無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，每孔1 mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，然后置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后，收集各孔培養(yǎng)上清液，高速離心機(jī)(相對(duì)離心力為152×g)離心20 min，取上清液，置于無(wú)菌EP管中，分裝后-20℃冷凍保存，用 ELISA 檢測(cè)其中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3 濃度，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度(A450)OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)品OD值及其相對(duì)應(yīng)的濃度，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，作一標(biāo)準(zhǔn)曲線并用公式表現(xiàn)出來(lái)，將樣本的OD值代入計(jì)算即可得出樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各組檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)資料經(jīng)W檢測(cè)呈正態(tài)分布，經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差，檢測(cè)平均濃度值用以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，以 P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

采用ELISA檢測(cè)，得到各個(gè)標(biāo)本中MMPs、TIMPs濃度表達(dá)。MMP-1的表達(dá):CCh成纖維細(xì)胞的濃度明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.40，P＜0.05)。MMP-3的表達(dá):CCh成纖維細(xì)胞的濃度明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.79，P＜0.01)。TIMP-1的表達(dá):CCh成纖維細(xì)胞的濃度與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.05，P＞0.05)。TIMP-3的表達(dá):CCh成纖維細(xì)胞的濃度明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.74，P＜0.05)。見(jiàn)表 1。

表1 兩組成纖維細(xì)胞中MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3濃度比較(，ng/mL)

表1 兩組成纖維細(xì)胞中MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3濃度比較(，ng/mL)

注:a示與CCh組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

MMP-1 MMP-3 TIMP-1 TIMP-3 CCh組組別437.62 ±13.62 0.29 ±0.02 0.48 ±0.00 0.17 ±0.01正常對(duì)照組 404.74 ±9.68a 0.15 ±0.02a 0.49 ±0.01 0.19 ±0.00a F值0.40 0.79 1.05 0.74 P值 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05

3 討論

隨著人口老年化加快，CCh的患病人數(shù)將不斷增多。Zhang等［1，9］報(bào)道，60 歲及以上人群中 CCh 患病率為44.08%。近年研究發(fā)現(xiàn)MMPs及TIMPs參與了球結(jié)膜ECM穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，其功能失調(diào)可能參與了CCh的病理過(guò)程［7-8］。

MMPs是水解ECM的蛋白裂解酶，包括基質(zhì)中以及整合于質(zhì)膜中的各種膠原酶和彈性蛋白酶等，是以ECM成分為水解底物的蛋白酶家系，主要在ECM的降解和重建中起作用。在正常的生理狀態(tài)下，ECM處于不斷產(chǎn)生和降解的動(dòng)態(tài)平衡中;病理狀態(tài)下，ECM的產(chǎn)生和(或)降解失平衡使其過(guò)多堆積 ，從而導(dǎo)致組織病理學(xué)方面的改變，產(chǎn)生相應(yīng)的疾病。

MMPs主要分為 5 類，其中，膠原酶(MMP-l、8、13)主要降解 I、Ⅱ、Ⅲ型膠原;基質(zhì)降解酶(MMP-3、7、10、11、12)廣泛降解ECM。TIMPs是機(jī)體自發(fā)產(chǎn)生的特異性抑制 MMPs功能的一組蛋白質(zhì)，目前研究發(fā)現(xiàn)TIMPs的 成 員 有 4 個(gè):TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。它們可下調(diào)MMPs的活性，對(duì)于維持ECM的穩(wěn)態(tài)有重要作用。TIMP-1是體內(nèi)MMP-1的天然特異性組織抑制劑，可抑制 MMP-1酶原活化及其活性。TIMP-3是一種結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)的非可溶性蛋白，調(diào)節(jié)MMP-3蛋白水解活性，協(xié)調(diào)ECM的降解與重建。在生理?xiàng)l件下，MMPs和TIMPs之間保持動(dòng)態(tài)平衡，以確保正常生理功能的進(jìn)行;但在某些病理?xiàng)l件下，這種生理平衡狀態(tài)被打破，從而對(duì)組織表現(xiàn)出極大的破壞力而致病。MMPs和TIMPs表達(dá)水平失衡與眼科疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

李青松等［7］研究顯示CCh球結(jié)膜組織中MMP-1、MMP-3表達(dá)較高，MMPs與 TIMPs平衡失調(diào)。Meller等［11］對(duì)CCh與正常結(jié)膜的成纖維細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，CCh組結(jié)膜成纖維細(xì)胞MMP-1和MMP-3過(guò)度表達(dá)。Li等［8］對(duì)正常結(jié)膜和CCh來(lái)源的結(jié)膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，CCh患者成纖維細(xì)胞MMP-1和MMP-3蛋白表達(dá)在CCh中明顯增加，分別為正常組的3.5～7.6倍及2.3～13倍。在 CCh中，MMP-3的酶蛋白溶解活性和MMP-1的膠原酶溶解活性增強(qiáng)。這些研究結(jié)果提示MMPs與TIMPs的失衡導(dǎo)致了球結(jié)膜基質(zhì)和Tenon囊的過(guò)度降解，而發(fā)生CCh。

本研究中采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMPs的表達(dá)情況，采用CCh成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法［10］，選取3～6代呈對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞，排除了原代培養(yǎng)中可能存在的上皮細(xì)胞。簡(jiǎn)單純化了體外實(shí)驗(yàn)的研究環(huán)境，排除了細(xì)胞混雜因素的干擾，直接檢測(cè)CCh成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3 的表達(dá)。

本研究中CCh組成纖維細(xì)胞MMP-1、MMP-3呈高表達(dá)，表明大部分釋放出胞外，胞內(nèi)貯存的較少，證實(shí)了CCh是多種因素導(dǎo)致ECM的改變，使細(xì)胞內(nèi)大部分MMP-1、MMP-3釋放到細(xì)胞外維持ECM的穩(wěn)定。TIMP-1的表達(dá)與正常對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)外MMP-1/TIMP-1失去平衡。TIMP-3的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，釋放到細(xì)胞外的較少，大部分儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)外MMP-3/TIMP-3失去平衡。這些研究結(jié)果提示在CCh中MMP-1的表達(dá)水平明顯升高，而TIMP-1并沒(méi)有隨之相應(yīng)的升高，同時(shí)，MMP-3的表達(dá)水平明顯升高，而TIMP-3的表達(dá)卻降低，上述球結(jié)膜成纖維細(xì)胞MMPs及TIMPs的病理表達(dá)可能參與了CCh的發(fā)生。對(duì)于MMPs、TIMPs的表達(dá)改變的機(jī)制及途徑還需進(jìn)一步深入的研究。

［1］Zhang X，li Q，Zou H，et al.Aessing the severity ot conjunctivochalasis in a senile population:a community-based epidemiology study in Shanghai，China［J］.BMC Public Health ，2011，11:198-203.

［2］張興儒，俞彰，劉曄翔，等.結(jié)膜松弛癥超微結(jié)構(gòu)電鏡研究［J］.中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2003，3(4):223-224.

［3］李軼捷，張興儒，項(xiàng)敏泓，等.結(jié)膜松弛癥球結(jié)膜及筋膜組織的超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2012，30(7):638-640.

［4］張興儒，蔡瑞霞，王寶華，等.結(jié)膜松弛癥的病理組織學(xué)觀察［J］.中華眼科雜志，2004，40(1):37-39.

［5］Zhang XR，Zhang ZY，Hoffman MR，et al.The effect of age and conjunctivochalasis on conjunctival thickness［J］.Curr Eye Res ，2013，38(3):331-334.

［6］Zhang XR，Zhang ZY，Hoffman MR.Conjunctival thickness measured by optical coherence tomography［J］.Ophthalmology，2013，120(6):1305.

［7］李青松，張興儒，項(xiàng)敏泓，等.基質(zhì)金屬蛋白酶在結(jié)膜松弛癥球結(jié)膜組織中的表達(dá)［J］.中華眼科雜志，2010，46(9):838-840.

［8］Li DQ，Meller D，Liu Y，et al.Overexpresion of MMP-l and MMP-3 by cultured conjunctivochalasis fibroblasts［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(2):404-410.

［9］Zhang XR，Zou HD，Li QS，et al.Comparison study of two diagnostic and grading systems for Conjunctivochalasis［J］.Chin Med J(Engl)，2013，126(16):3118-3123.

［10］韓竹梅，張興儒，張隆，等.結(jié)膜松弛癥成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定［J］.眼科，2013，22(2):105-109.

［11］Meller D，Li DQ，Tseng SC.Regulation of collagenase，stromelysin，and gelatinase B in human conjunetival and conjunctivochalasis fibroblasts by interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(10):2922-2929.