沈 晗 邵紅偉 黃樹林 (廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州510006)

T細胞抗原受體(TCR)是T細胞表面的特征性標(biāo)志分子，其與CD3分子組成的TCR-CD3復(fù)合體，是進行抗原識別，發(fā)揮細胞免疫重要功能的基礎(chǔ)。一般認為，TCR必須識別抗原肽-MHC分子復(fù)合物才能活化T細胞，其中CD4+T細胞識別MHCⅡ類抗原，CD8+T細胞識別MHCⅠ類抗原。TCR分子是由兩條不同肽鏈構(gòu)成的跨膜蛋白，肽鏈的種類有α、β、γ、δ 四種，根據(jù)組合的差異，可分為 TCRαβ+T細胞和TCRγδ+T細胞，其中TCRαβ+T細胞在發(fā)揮特異性細胞免疫過程中發(fā)揮重要作用。有關(guān)TCRαβ分子識別抗原肽-MHC分子復(fù)合物的基本分子機制已形成了經(jīng)典的免疫學(xué)理論，但其中有關(guān)MHC分子限制性、CD4及CD8分子的輔助性以及TCR分子α鏈與β鏈在識別過程中的地位及作用等問題還存在不少存有爭議的地方，本文將介紹相關(guān)領(lǐng)域的研究進展，并結(jié)合自己的綜合分析，對TCRαβ分子識別抗原肽-MHC復(fù)合物過程中的一些爭議問題進行探討。

1 TCR分子識別抗原肽的MHC非限制性機制

對于TCR識別抗原肽的MHC分子限制性問題也有著不同的觀點，在較早期的研究中[1]，已有研究者證實利用高濃度的抗HLA抗體封閉HLA分子后CTL仍能夠裂解靶細胞，但由于當(dāng)時已知的HLA亞型沒有現(xiàn)在全面，所制備的抗體也是有限的，且在這些實驗中都是利用的高E∶T比(效應(yīng)細胞與靶細胞比例)的實驗方式，而當(dāng)時的實驗對照組也出現(xiàn)了靶細胞被裂解的現(xiàn)象，所以并不能用此結(jié)果來證明CTL的殺傷過程是非MHC限制性的;后來有研究小組建立了兩個CTL克隆，其只表達一種類型的TCRαβ分子，但具有HLA限制與非限制性兩種機制介導(dǎo)的對靶細胞的識別和殺傷能力[2]。要明確TCRαβ對抗原的非MHC限制性識別機制必須找到TCR分子識別的抗原表位，但目前有關(guān)這方面的報道非常有限，有研究證實，在外周血中確實存在一些特殊的TCRαβT細胞，它們的TCR分子可能通過非MHC限制性機制，識別一些結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜的抗原分子，從而被活化[3]。近年來關(guān)于肽類抗原被TCRαβ非MHC限制性識別的報道只發(fā)現(xiàn)了唯一一種抗原表位-粘蛋白 Mucin 1(MUC1)[4，5]，它是表達在導(dǎo)管上皮細胞和其來源的各種腫瘤細胞上的一種跨膜糖蛋白，超過80%的人類癌癥都表達MUC1分子[6]，研究發(fā)現(xiàn)TCR與MUC1結(jié)合的抗原表位是由20個氨基酸進行超過100個串聯(lián)重復(fù)而成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)排列有序且十分牢固，與TCR具有很高的親和力[7];TCRαβ對其的特異性識別不需要MHC分子的參與，但T細胞上的其他共刺激分子在識別中發(fā)揮重要作用，其中 ICAM-1、LFA-1、LFA-3和 CD2分子與MUC1抗原表位的相互作用是CTL完全活化的必需條件，而CD8分子在此過程中也發(fā)揮一定作用。如果 CTL只依靠 TCRαβ識別 MUC1抗原肽，只能部分活化 CTL，微觀上只表現(xiàn)出短暫的Ca2+內(nèi)流，而沒有ZAP-70等關(guān)鍵活化信號通路分子的磷酸化出現(xiàn)，CTL也不出現(xiàn)增殖反應(yīng);如果有了上述黏附分子的參與，則可以介導(dǎo)CTL的完全活化，整個過程與MHC限制性抗原肽激活CTL的情況沒有明顯區(qū)別[8]。TCR對其他非肽類抗原表現(xiàn)出的非MHC限制性識別的報道比較多見，包括細菌包膜脂類、糖蛋白上的糖鏈部分等[9，10]，相比較而言，非MHC限制性的肽類抗原發(fā)現(xiàn)得實在太少。通過以上的研究報道我們推斷，肽類抗原的非MHC限制性識別并不是抗原識別的普遍現(xiàn)象，可能只是作為經(jīng)典的MHC限制性識別理論的一種補充，且主要發(fā)生在那些結(jié)構(gòu)(抗原表位)極為復(fù)雜的蛋白質(zhì)上，同時這種識別雖不需要MHC限制性，但單純的依靠TCRαβ分子與這些抗原表位的相互作用也不能徹底完成對T細胞的活化，還需要其他相關(guān)黏附分子的參與[8]。近年來，也發(fā)表了一些關(guān)于T細胞非MHC限制性識別的研究報道，Somasundaram等人[11]研究發(fā)現(xiàn)，從原發(fā)性黑色素瘤病人的外周血淋巴細胞中建立了一株CD8+CTL克隆，表現(xiàn)為對所有HLA亞型(包括Ⅰ類和Ⅱ類)的黑色素瘤細胞都有識別殺傷活性，因此，CTL克隆對黑色素瘤的抗原識別是非HLA限制性的，而研究顯示其對其他腫瘤細胞無殺傷活性，由于黑色素瘤細胞并不表達MUC1抗原肽，所以可能存在著其他黑色素瘤相關(guān)抗原介導(dǎo)了這種非MHC限制性的抗原識別反應(yīng)的發(fā)生。在最近的一項報道中，研究者建立了一株CD4+T細胞克隆，它能夠以非MHC限制性方式識別并裂解自體與異體的人腎癌細胞，進一步分析其TCR分子配體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)配體中并不包含MHC分子配基結(jié)構(gòu)[12，13]。由此可見，我們對于經(jīng)典的MHC限制性識別過程的認識仍然有待更加深入的研究。

2 CD4與CD8分子在MHC限制性TCR識別抗原肽中的作用

TCR對抗原肽的MHC限制性識別既涉及到MHC分子對抗原肽的呈遞，又需要TCR識別抗原肽的輔助受體CD4和CD8分子的參與，經(jīng)典免疫學(xué)理論認為，CD4分子與MHCⅡ類分子結(jié)合，CD8分子與MHCⅠ類分子結(jié)合，起到增加TCR與抗原肽-MHC復(fù)合物相互作用的敏感性和牢固性，促進T細胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[14，15]。但近年來的一些研究對CD4、CD8分子與MHC分子結(jié)合的必需性和限制性(即CD4必須與MHCⅡ類分子結(jié)合，CD8分子必須與MHCⅠ類分子結(jié)合)提出了新的認識。有研究發(fā)現(xiàn)，CD4分子實際上與MHCⅡ類分子的親和力非常低下，對提高TCR分子與抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定性并沒有幫助[16，17]。而CD8分子在大多數(shù)MHCⅠ類分子限制性T細胞識別抗原肽的過程中都是必需的，這些T細胞所表達的TCR一般屬于抗原肽低親和力TCR，CD8分子能夠提高TCR分子與抗原肽-MHC復(fù)合物的親和力;而在一些表達抗原肽高親和力TCR的T細胞，其對特定抗原肽的識別和殺傷對CD8分子的表達不是必需的，這種TCR分子在結(jié)構(gòu)上與特定抗原表位具有很高的契合性，能充分結(jié)合抗原肽/MHCⅠ類分子復(fù)合物，這樣不需要CD8輔助受體的參與，就能為T細胞的完全活化提供必需的信號[18，19]。由于目前發(fā)現(xiàn)MHCⅠ類腫瘤相關(guān)抗原肽的種類較多，Ⅱ類抗原肽較少，因此，有人用識別特異性MHCⅠ類抗原肽的高親和力TCR分子修飾CD4+T細胞，使其表達這種TCR，經(jīng)過改造后的CD4+T細胞能夠特異性地識別抗原呈遞細胞呈遞的此種MHCⅠ類抗原肽(但不能直接識別腫瘤細胞表面的抗原肽)，能夠被完全活化，分泌相應(yīng)細胞因子并克隆增殖[20]?？梢钥闯?，如果TCR分子與特異性抗原肽-MHC復(fù)合物的結(jié)合能力很強，那么T細胞對該抗原肽的識別和隨后自身的活化是不依賴CD8分子的，所表達的這種高親和力特異性TCR分子是識別過程的關(guān)鍵所在。最新的研究結(jié)果顯示，CD4與CD8分子的主要功能是對T細胞膜內(nèi)酪氨酸激酶Lck的募集，進而促進其與TCR/CD3復(fù)合物的作用，將活化信號傳入T細胞內(nèi)，與CD4、CD8分子是否促進TCR-抗原肽MHC復(fù)合物親和力沒有關(guān)系[21，22]。值得注意的一點是，如果TCR分子與其特定識別的抗原/MHC復(fù)合物的親和力過高，當(dāng)T細胞遇到該種抗原時導(dǎo)致活化誘導(dǎo)的細胞死亡(AICD)發(fā)生[23]。同時有研究證實，TCR與抗原/MHC復(fù)合物的親和力高低并不與T細胞后續(xù)的活化程度成正比，而T細胞的高活性也并非絕對的需要T細胞對抗原的高效識別[19]，但也有其他一些研究的觀點與此相反[24]。出現(xiàn)這些矛盾結(jié)果的原因可能是由于不同研究者所選取的實驗?zāi)Ｐ图胺椒ǖ牟町愒斐傻模贿^有一點是我們可以肯定，即TCR與其特異性識別的抗原/MHC復(fù)合物之間的親和力高低影響著后續(xù)T細胞的反應(yīng)，在正常情況下，二者是相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，能保證T細胞發(fā)揮正常的免疫功能，但如果出現(xiàn)特殊情況(例如腫瘤、自身免疫病等)，T細胞識別抗原能力的變化則可能導(dǎo)致T細胞的免疫功能失調(diào)。

3 TCR分子α鏈與β鏈在識別抗原肽-MHC復(fù)合物中的功能及地位

我們知道TCR分子由一條α鏈和一條β鏈組裝而成，那么在識別過程中是α鏈和β鏈的哪些具體部位發(fā)揮識別作用，二者在抗原識別中的地位是否同等重要等問題都需要我們深入理解。TCRα鏈和β鏈都由可變區(qū)(V區(qū))和恒定區(qū)(C區(qū))兩部分組成，V區(qū)又可分為CDR1、CDR2、CDR3和HV4四區(qū)，其中的CDR3區(qū)被認為是識別抗原肽-MHC復(fù)合物的關(guān)鍵部位，由于CDR3區(qū)是由V、(D)、J片段的重排連接后的基因片段編碼而成，連接處可隨機插入或丟失數(shù)個核苷酸，使最終翻譯得到的CDR3區(qū)高度變化，因此要得到兩個氨基酸序列完全相同的CDR3區(qū)幾乎不太可能[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，在抗原識別過程中，TCR分子V區(qū)中的CDR1和CDR2區(qū)與MHC分子的識別密切相關(guān)，而HV4區(qū)在超抗原與TCRVβ鏈的結(jié)合時發(fā)揮重要作用，但真正起到對抗原肽特異性識別作用的主要還是CDR3區(qū)[26]。有人建立了TCRα鏈和β鏈轉(zhuǎn)基因小鼠模型[27]，利用不同的抗原肽免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)TCR分子氨基酸序列的改變主要發(fā)生在Vα和Vβ鏈的CDR3區(qū)，利用X射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振技術(shù)對TCR與抗原肽-MHC復(fù)合物的結(jié)合位點進行分析，發(fā)現(xiàn)TCR的CDR3環(huán)狀結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位點直接與抗原肽特定表位的氨基酸殘基結(jié)合，而MHC分子的保守氨基酸殘基與TCR分子的V區(qū)廣泛結(jié)合，所以，就是通過特定蛋白質(zhì)殘基之間的非共價結(jié)合作用保證了TCR對抗原肽-MHC復(fù)合物的充分識別[28]。

由于TCRVαβ是由Vα和Vβ鏈共同構(gòu)成了抗原肽-MHC復(fù)合物的識別位點，那么Vα和Vβ這兩條鏈在識別過程中發(fā)揮作用的地位是否完全等同呢?利用單鏈TCR轉(zhuǎn)基因小鼠實驗，研究者對這個問題進行了較深入研究。有研究者報道，TCR的Vα和Vβ鏈在抗原識別過程中發(fā)揮的作用同等重要[29];但也有更多的實驗結(jié)果證實，在抗原識別過程中，TCRVα鏈起著決定性的作用。有人利用同一TCRVα鏈與不同的TCRVβ鏈進行配對，建立表達這種雜合狀態(tài)TCR分子的轉(zhuǎn)基因小鼠和T細胞克隆，進行特異性抗原的識別實驗，發(fā)現(xiàn)雖然TCRVβ鏈的組成各異，但只要具有相同的TCRVα鏈，這種基因改造的T細胞表現(xiàn)出針對同一種抗原的特異性[30，31]。利用X射線晶體衍射技術(shù)觀察分子間相互作用時發(fā)現(xiàn)，TCRVα的氨基酸位點在抗原肽識別中起關(guān)鍵性作用，因為TCRVα的CDR3區(qū)插入到抗原肽-MHC復(fù)合物中的空間面積比CDR3β更大，具體分析TCR分子與抗原肽相接觸的位點發(fā)現(xiàn)，在總共27個接觸點中有23個位于Vα鏈而只有4個涉及到Vβ鏈，除此之外，TCR分子與抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合的支點和轉(zhuǎn)向角會調(diào)節(jié)CDR3α區(qū)與抗原肽的接觸位點[30，34]。在針對 HIV-P18 抗原肽的TCR識別實驗中，證實TCRVα鏈表現(xiàn)出Vα42H1-Jα25基因的表達特異性，而與之配對的TCRVβ鏈則表現(xiàn)為基因重排后的多樣性(即表現(xiàn)為各種不同的TCRVβ基因家族)[32];利用黑色素瘤相關(guān)抗原Melan-A誘導(dǎo)出特異性識別該抗原的多個T細胞克隆，然后利用測序技術(shù)檢測這些T細胞克隆編碼TCRVα和Vβ鏈基因的序列，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)TCRVα基因表現(xiàn)出Vα2.1+表型，而TCRVβ基因則表現(xiàn)出明顯的多樣性[33];而有研究者利用黑色素瘤分化抗原TRP-2的基因疫苗免疫動物，也發(fā)現(xiàn)了TCRVα5基因的優(yōu)勢表達[34]。最近的一項研究證實[35]，TCR CDR3α區(qū)氨基酸序列的特異性決定著肽與TCR分子結(jié)合的特異性，而CDR3β區(qū)只是與肽存在接觸關(guān)系，與肽識別的過程只與其長度的多少有關(guān)，不涉及其氨基酸序列。從以上這些報道中可以明顯地發(fā)現(xiàn)，TCRVα鏈在抗原肽-MHC復(fù)合物特異性識別過程中發(fā)揮了決定性的作用，決定了TCR對抗原肽識別的特異性這一關(guān)鍵問題，為什么會出現(xiàn)這種情況呢?我們可以從TCR分子的發(fā)育過程找到一些可能的解釋，在生理狀態(tài)下，T細胞的發(fā)育過程中首先進行的是TCRβ鏈的重排，然后具有完整β鏈的嵌合T細胞再進行α鏈的重排，這樣最終生成的具有完整TCRαβ鏈的T細胞中，如果具有相同的β鏈(其概率也是比較低的)，要使他們的α鏈也相同的概率就更低了，因為α鏈的重排時間在后，同一條β鏈(其概率也很小)可能與多條α鏈搭配，而同一條α鏈幾乎不可能與超過一條的β鏈相搭配，所以我們可以推斷，TCR分子對抗原肽識別的多樣性和特異性更多地體現(xiàn)在α鏈上[31]。當(dāng)然，TCR分子既然由α和β兩條鏈構(gòu)成，在抗原識別過程中，β鏈的作用也是不容忽視的，有些研究也發(fā)現(xiàn)，抗原刺激后也會出現(xiàn)一些TCRVβ基因的優(yōu)勢表達;不同的Vβ鏈與同一Vα鏈組合后對抗原的結(jié)合能力存在差異，有些類型的Vβ鏈與Vα鏈組合后能表現(xiàn)出更強的抗原識別作用，更利于活化T細胞;β鏈的多樣性在TCR分子組裝與識別功能中有重要作用[36]。同時，我們也應(yīng)注意到，參與TCR識別抗原肽-MHC復(fù)合物過程中的其他輔助分子對整個識別活化過程的成功也是必不可少的[37]。

4 結(jié)語

以上雖就有關(guān)TCR分子特異性識別某種抗原肽-MHC復(fù)合物過程中存在爭議的部分問題做了分析和論述，但我們可以看到整個識別過程實際上是十分復(fù)雜多變的，各分子在識別過程中的地位可能在T細胞識別不同抗原時發(fā)生顯著的變化，因此在很多情況下不能單單依靠簡單的體外實驗?zāi)Ｐ瓦M行確證，可能還需要設(shè)計更加合理的實驗盡可能地模擬生物體內(nèi)環(huán)境中T細胞識別抗原的真實過程，只有這樣才可能系統(tǒng)、全面、切實地揭開TCR對抗原肽-MHC復(fù)合物的識別機理。

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