張恩勝 王 軍 萬雪媛 潘兆軍 曹 楊 (山東省滕州市中心人民醫(yī)院新生兒科，滕州277550)

人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)屬β皰疹病毒亞科，具有較嚴(yán)格的種屬特異性和潛伏-激活的特征，嬰幼兒尤其是新生兒HCMV感染會引起肝功能損害、肝脾腫大、感覺神經(jīng)性耳聾(Sensorineural hearing loss，SNHL)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[1，2]。巨細(xì)胞病毒肝炎的發(fā)病機(jī)理與巨細(xì)胞病毒侵襲肝細(xì)胞后導(dǎo)致的免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)[3]，但其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明。

輔助性17細(xì)胞(Th17)是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T輔助細(xì)胞亞群，能特異性地產(chǎn)生 IL-17效應(yīng)因子[4]。研究表明，Th17細(xì)胞介導(dǎo)了多種自身免疫疾病的組織損傷，Ramon Arens[5]等研究發(fā)現(xiàn)，在鼠巨細(xì)胞病毒 (Murine cytomegalovirus，MCMV)感染的小鼠脾和肺組織中有IL-17的表達(dá)。IL-23是維持Th17細(xì)胞亞群分化和穩(wěn)定的重要因子，對維持Th17細(xì)胞增殖和穩(wěn)定起著重要作用[6，7]。本實(shí)驗(yàn)通過建立MCMV感染BALB/c新生小鼠肝炎模型，觀察治療前后小鼠外周血及肝臟中IL-17、IL-23的變化情況，進(jìn)而推測MCMV感染對新生小鼠Th17亞群的影響，為MCMV肝炎的免疫致炎機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒培養(yǎng) 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T3細(xì)胞)、MCMV Smith株(引自北京空軍總醫(yī)院)，按常規(guī)方法培養(yǎng)傳代。測定病毒致半數(shù)細(xì)胞感染量TCID50為104.31/0.1ml。

1.1.2 動物 SPF級BALB/c性成熟小鼠，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.3 藥品 更昔洛韋，國藥準(zhǔn)字:H10980189，規(guī)格為50 mg/瓶，湖北科益藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 主要試劑與儀器 日本產(chǎn)OLYMPUS AU5400全自動生化分析儀;IL-17 ELISA試劑盒(M2300，美國 R＆D Systems公司);IL-23 ELISA 試劑盒(M1700美國R＆D Systems公司);中性甲醛;脫鈣液;DNA提取試劑盒、PCR試劑盒(均購自北京天根生物工程有限公司);MCMV-PCR上游引物:5'-TCAGCCATCAACTCTGCTACCAAC-3'，下游引物:5'-ATCTGAAACAGCCGTATATCATCTTG-3'[8]， IL-17、IL-23(p19亞基)和看家基因β-肌動蛋白(β-actin)基因序列經(jīng)GenBank獲得，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)目的基因和β-actin的引物，上海生工生物技術(shù)有限公司合成引物(引物序列見表1)。

1.2 方法

1.2.1 MCMV的活化與擴(kuò)增 MCMV經(jīng)3T3細(xì)胞擴(kuò)增活化，并采用細(xì)胞病變法滴定病毒 TCID50(104.31/0.1 ml)。

1.2.2 動物分組 SPF級BALB/c新生小鼠72只，隨機(jī)分為正常對照組、病毒組、更昔洛韋治療組，每組24只新生小鼠。對照組腹腔注射生理鹽水20 μl，病毒組腹腔接種 MCMV 20 μl，治療組于接種病毒后當(dāng)日腹腔注射更昔洛韋60 mg/(kg·d)，連用2周，母乳喂養(yǎng)，每日觀察小鼠的發(fā)育狀況。

1.2.3 取材 造模后第3、7、14天小鼠摘除眼球取血。水合氯醛按0.3 ml/100 g的劑量麻醉新生小鼠，75%酒精浸泡小鼠2～3分鐘，將小鼠置于生物安全柜內(nèi)，同時準(zhǔn)備好手術(shù)器械:固定小鼠四肢于泡沫板，在劍突處劃開皮膚，向上下縱行剪開，切開腹膜后取肝臟，分置于凍存管內(nèi)，-80℃保存?zhèn)溆谩⒏闻K置于中性甲醛中固定、脫鈣、石蠟切片、HE染色、光鏡觀察。

1.2.4 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測 采集小鼠血液樣本后，全自動生化分析儀檢測血清ALT水平。

1.2.5 ELISA法測血清IL-17、IL-23蛋白濃度 采集小鼠血液樣本并分離血漿，按照ELISA試劑盒說明檢測小鼠IL-17、IL-23的表達(dá)水平，根據(jù)樣品的OD值用Excel2008計(jì)算出相應(yīng)IL-17、IL-23濃度。

1.2.6 PCR檢測 采用蛋白酶K裂解法提取MCMV進(jìn)行MCMV-PCR檢測。同時用RT-PCR法進(jìn)行小鼠肝臟 IL-17mRNA、IL-23mRNA檢測。反應(yīng)體系:DNA 模板(肝臟提取)2 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，Taq 酶 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl，共 25 μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3分鐘;然后執(zhí)行35個循環(huán):94℃變性30秒，各目的基因的退火溫度見表1，退火30秒，72℃延伸40秒，最后72℃總延伸5分鐘。電泳條件:100 mV電泳40分鐘。以S1000 Thermal-Cycler PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，以GIS-2008型數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量數(shù)據(jù)以

表1 IL-17、IL-23、MCMV及β-actin引物序列Tab．1 Primer sequence of mouse IL-17，IL-23，MCMV and β-actin

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況及肝組織病理學(xué)檢查 小鼠于腹腔注射MCMV后生長發(fā)育緩慢(皮毛凌亂稀疏、缺乏光澤、睜眼延遲、活動差、體型略顯消瘦)。3天后肝臟HE染色，光鏡下可見肝細(xì)胞氣球樣變性，點(diǎn)灶狀壞死，門管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞核內(nèi)病毒包涵體，提示造模成功。

2.2 肝組織MCMV-DNA PCR檢測結(jié)果 對照組肝臟組織MCMV-DNA PCR電泳各時間點(diǎn)均未見陽性條帶;病毒組MCMV-DNA PCR電泳全部出現(xiàn)陽性條帶，提示小鼠肝臟有MCMV感染;更昔洛韋治療組與病毒組相比MCMV-DNA PCR電泳陽性條帶的亮度明顯減低，提示更昔洛韋對肝臟MCMV感染病毒的復(fù)制有明顯的抑制作用(見圖1)。

2.3 血清ALT水平 由(表2)可見，與正常對照組相比，病毒組小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高，7天時達(dá)高峰，14天時下降;與病毒組相比，更昔洛韋治療組ALT水平在3天時即有明顯下降，7天時進(jìn)一步下降，14天時接近正常。

圖1 MCMV感染新生小鼠不同時期肝臟中MCMV PCR電泳圖Fig．1 MCMV PCR electrophoresis of different periods MCMV infection of the liver in the newborn mice

表2 三組小鼠血清ALT比較(±s)Tab．2 The comparison of the three groups of mice serum ALT(±s)

表2 三組小鼠血清ALT比較(±s)Tab．2 The comparison of the three groups of mice serum ALT(±s)

Note:1)P＜0.01，compared with the control group in the corresponding point;2)P＜0.01，compared with the virus group in the corresponding point;3)P＜0.05，compared with the virus group in the corresponding point;4)P＞0.05，compared with the control group in the corresponding point.

Groups sALT(U/L)9.83 Virus group 59.68±11.641)175.64±58.071)162.09±16.481)Treatment group 41.62±11.323)93.87±60.272)28.97±8.762)4)3d 7d 14d Control group 25.16±10.72 24.89±8.59 27.36±

2.4 血清IL-17、IL-23水平 病毒組小鼠自感染第3天血清中IL-17、IL-23水平開始升高，并維持較高水平，直至第14天仍高于正常對照組;治療組小鼠自治療后3天，血清IL-17、IL-23水平開始下降，并持續(xù)下降直至治療后第14天。治療組各時點(diǎn)血清IL-17、IL-23水平仍高于正常對照組。病毒組各時點(diǎn)IL-17、IL-23蛋白表達(dá)量均高于正常對照組相應(yīng)時點(diǎn)(P＜0.01);對照組各時點(diǎn)IL-17、IL-23蛋白表達(dá)量比較差異無顯著性(P＞0.05);治療組治療7、14天后IL-17、IL-23蛋白表達(dá)量低于病毒組相應(yīng)時點(diǎn)(P ＜0.01)。見表3、4。

2.5 肝臟中IL-17、IL-23mRNA水平 病毒組小鼠自感染第3天肝組織中IL-17、IL-23mRNA水平開始升高，并維持較高水平，直至第14天仍高于正常對照組;治療組小鼠自治療后3天，IL-17、IL-23mRNA水平開始下降，并持續(xù)下降直至治療后第14天。治療組各時點(diǎn)IL-17、IL-23mRNA水平仍高于正常對照組。病毒組各時點(diǎn)IL-17、IL-23mRNA表達(dá)量均高于正常對照組相應(yīng)時點(diǎn)(P＜0.01);對照組各時點(diǎn)IL-17、IL-23mRNA表達(dá)量比較差異無顯著性(P＞0.05);治療組治療 7天、14天后 IL-17、IL-23mRNA表達(dá)量低于病毒組相應(yīng)時點(diǎn)(P＜0.01)。見表5、6，圖2 ～5。

表3 三組小鼠血清IL-17比較(±s)Tab．3 The comparison of the three groups of mice serum IL-17(±s)

表3 三組小鼠血清IL-17比較(±s)Tab．3 The comparison of the three groups of mice serum IL-17(±s)

Note:1)P＜0.01，compared with the control group in the corresponding point;2)P＜0.01，compared with the virus group in the corresponding point.

.77 Virus group 43.05±8.461) 67.41±10.991)91.24±18.051)Treatment group 41.83±8.41 46.19±14.972)29.51±6.412)3 d 7 d 14 d Control group 13.84±2.19 15.31±1.36 15.29±1 Groups IL-17(ng/L)

表4 三組小鼠血清IL-23比較(±s)Tab．4 The comparison of the three groups of mice serum IL-23(±s)

表4 三組小鼠血清IL-23比較(±s)Tab．4 The comparison of the three groups of mice serum IL-23(±s)

Note:1)P＜0.01，compared with the control group in the corresponding point;2)P＜0.01，compared with the virus group in the corresponding point.

.41 Virus group 33.07±4.471) 50.41±10.011)66.29±12.131)Treatment group 29.38±3.96 32.61±7.252) 19.59±3.942)3 d 7 d 14 d Control group 10.72±2.05 11.13±1.71 11.12±1 Groups IL-23(ng/L)

表5 IL-17mRNA在小鼠肝臟中的表達(dá)情況(±s)Tab．5 The expression of IL-17mRNA in the liver of newborn mice(±s)

表5 IL-17mRNA在小鼠肝臟中的表達(dá)情況(±s)Tab．5 The expression of IL-17mRNA in the liver of newborn mice(±s)

Note:1)P＜0.01，compared with the control group in the corresponding point;2)P＜0.01，compared with the virus group in the corresponding point.

Groups IL-17/β-action 3 d 7 d 14 d Control group 0.37±0.06 0.37±0.07 0.41±0.05 Virus group 1.23±0.161) 1.67±0.161) 1.94±0.241)Treatment group 1.19±0.15 1.26±0.222) 1.23±0.142)

表6 IL-23mRNA在小鼠肝臟中的表達(dá)情況(±s)Tab．6 The expression of IL-23mRNA in the liver of newborn mice(±s)

表6 IL-23mRNA在小鼠肝臟中的表達(dá)情況(±s)Tab．6 The expression of IL-23mRNA in the liver of newborn mice(±s)

Note:1)P＜0.01，compared with the control group in the corresponding point;2)P＜0.01，compared with the virus group in the corresponding point;3)P＜0.05，compared with the virus group in the corresponding point.

Groups IL-23/β-action 3 d 7 d 14 d Control group 0.51±0.06 0.50±0.08 0.52±0.08 Virus group 0.75±0.111) 0.84±0.211) 1.03±0.191)Treatment group 0.70±0.12 0.65±0.113) 0.57±0.152)

圖2 MCMV感染新生小鼠不同時期肝臟中IL-17mRNA電泳圖Fig．2 Images of IL-17mRNA RT-PCR production in the liver of newborn mice

2.6 相關(guān)性分析 病毒組、治療組3、7天時IL-17、IL-23水平與ALT呈正相關(guān)(r值為0.691～0.803，P＜0.05)，對照組IL-17、IL-23水平與ALT無相關(guān)性(r值為-0.179～0.229，P ＞0.05)。

圖4 MCMV感染新生小鼠不同時期肝臟中IL-23mRNA電泳圖Fig．4 Images of IL-23mRNA RT-PCR production in the liver of newborn mice

圖5 IL-23mRNA在小鼠肝臟中的表達(dá)情況比較Fig．5 The expression of IL-17mRNA in the liver of newborn mice

3 討論

Th17是新近發(fā)現(xiàn)的一種Th細(xì)胞的亞型，能夠選擇性地分泌一些前炎癥細(xì)胞因子，主要為IL-17[4]。IL-17是一種重要的炎癥介質(zhì)，通過與其受體(lL-17R)結(jié)合，激活T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子(如 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，同時發(fā)現(xiàn)IL-17還參與中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的增殖、成熟及趨化過程，在炎癥過程中發(fā)揮重要作用[9]。

在一個關(guān)于皰疹病毒感染的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IL-17通過一個依賴中性粒細(xì)胞的程序促使老齡小鼠的死亡，中和IL-17或消耗中性粒細(xì)胞均可減少肝損害并降低老齡小鼠的死亡率，而中性粒細(xì)胞誘發(fā)的肝壞死是皰疹病毒感染死亡的重要原因[10]。Ge等[11]發(fā)現(xiàn)慢性乙型病毒性肝炎患者外周血Th17細(xì)胞比例及IL-17表達(dá)顯著升高且與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平呈正相關(guān)，提示Th17細(xì)胞與病毒感染后引起的組織損傷和免疫反應(yīng)有關(guān)。Lemmers等[12]研究發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者外周血中Th17細(xì)胞較正常人明顯升高，且可能存在丙型肝炎病毒(HCV)特異性Th17細(xì)胞。上述研究，有可能為闡明病毒性肝炎的免疫損傷機(jī)制提供依據(jù)。

本項(xiàng)目應(yīng)用MCMV Smith毒株建立MCMV感染小鼠模型，檢測其Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17的變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCMV感染新生小鼠自感染第3天可檢測到血清IL-17水平升高，并維持較高水平，至第14天時達(dá)峰值，MCMV感染新生小鼠肝組織IL-17mRNA的表達(dá)變化規(guī)律與血清相似，3、7天時與ALT呈正相關(guān)關(guān)系，通過更昔洛韋干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)血清IL-17水平、肝組織中IL-17mRNA水平呈下降趨勢，治療7、14天后IL-17的表達(dá)顯著低于MCMV感染組(P＜0.01)，提示MCMV感染發(fā)病過程不同時期都存在已分化的Th17細(xì)胞亞群，推測Th17細(xì)胞分化可能與新生小鼠MCMV感染發(fā)病過程中肝細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)損傷有關(guān)，表明Th17細(xì)胞可能在MCMV感染發(fā)病機(jī)制中有重要的作用。

IL-23是IL-12家族中的成員，主要通過促進(jìn)刺激Th17細(xì)胞分泌Th17相關(guān)的細(xì)胞因子IL-17發(fā)揮作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-23對于維持Th17細(xì)胞的功能具有重要的作用，IL-23也是一種重要的促炎因子，在維持和擴(kuò)增Th17細(xì)胞中起重要作用[7]。楊帆等[14]研究結(jié)果表明，重組IL-23能明顯增加Th17細(xì)胞數(shù)，伴有IL-17mRNA表達(dá)增加及培養(yǎng)上清液中IL-17分泌量增加，提示IL-23在維持Th17細(xì)胞增殖及分化中具有重要作用。IL-23主要是通過促進(jìn)刺激Th17細(xì)胞分泌Th17相關(guān)的細(xì)胞因子IL-17A和 IL-17F 而發(fā)揮作用[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)MCMV感染新生小鼠肝組織中IL-23mRNA和血清IL-23蛋白表達(dá)均成陽性，且較對照組小鼠肝脾組織和血清中的表達(dá)明顯增高(P＜0.01)，在急性期與ALT呈正相關(guān)關(guān)系，而且通過更昔洛韋干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)血清IL-23水平、肝組織中IL-23mRNA水平呈下降趨勢，治療7、14天后IL-23的表達(dá)顯著低于MCMV感染組(P＜0.01)，提示IL-23可能在MCMV感染的發(fā)病中起到了致病作用。在病毒的作用下，抗原呈遞細(xì)胞DC、吞噬細(xì)胞等活化，IL-23p19mRNA表達(dá)增加，翻譯成蛋白，與同時伴隨生成的p40組成具有生物學(xué)活性的IL-23，分泌到細(xì)胞外發(fā)揮其生物學(xué)作用。產(chǎn)生的IL-23通過有效的正反饋?zhàn)饔靡鹁奘杉?xì)胞和DC進(jìn)一步激活，使之產(chǎn)生IL-6、TNF-α等多種促炎物質(zhì)，增強(qiáng)抗原表達(dá)。此外，IL-23還可能激活NK細(xì)胞，分泌穿孔素，直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。

綜上所述，Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-23在MCMV感染發(fā)病過程中均有高表達(dá)，提示Th17相關(guān)性細(xì)胞因子 IL-17、IL-23可能參與了新生小鼠MCMV肝炎的發(fā)病。但其對MCMV感染中Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)激活、增殖分化調(diào)節(jié)等地免疫作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。Th17相關(guān)性細(xì)胞因子在MCMV感染中的研究對T細(xì)胞生物學(xué)功能及其臨床應(yīng)用開啟了新的篇章，對于發(fā)現(xiàn)治療MCMV感染新靶點(diǎn)有深刻意義。

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