劉月彩 耿玉蘭 劉澤世 沈 莉 單保恩 (河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊050031)

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多種因素作用的結(jié)果。機(jī)體免疫功能在控制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展方面發(fā)揮著重要的作用，機(jī)體免疫監(jiān)視功能的下降，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制因素以及腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸作用等是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的原因之一[1，2]，因此，提高機(jī)體的免疫功能，就有可能起到抗腫瘤的作用。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一種分子量約為30.4 kD的糖蛋白激素，EPO主要生理功能是作用于骨髓造血細(xì)胞，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖、分化和成熟，臨床上主要用于治療腎臟疾病、癌癥及放化療等引起的貧血。EPO對提高血紅蛋白水平，減少輸血需求，提高患者生活質(zhì)量發(fā)揮著重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)，EPO 對免疫系統(tǒng)有著廣泛的影響[3，4]，但對免疫系統(tǒng)影響主要來自于EPO治療腎衰竭貧血患者的研究，而有關(guān)EPO對腫瘤患者免疫功能影響的研究鮮有報(bào)道。本文旨在探討EPO對荷瘤小鼠紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞壓積(Hct)、血紅蛋白(Hb)含量、T淋巴細(xì)胞亞群分布和血清細(xì)胞因子含量的影響，以期對EPO用于臨床治療腫瘤相關(guān)性貧血和估計(jì)預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供，5～6周齡C57BL/6小鼠，雄性，體重18～20 g，購自中科院北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號:Scxk京-2005-0013);RPMI1640和胰蛋白酶購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司;EPO購自華北制藥有限公司;FITC標(biāo)記的抗小鼠CD8單克隆抗體(mAb)及PE標(biāo)記的CD4 mAb均購自eBioscience公司;小鼠TNF-α和IL-2 ELISA試劑盒購自ADL公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) B16細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) C57BL/6小鼠18只隨機(jī)分為3組:正常對照組、鹽水處理組和EPO處理組，每組6只。除正常對照組外每只小鼠右前腋皮下注射B16細(xì)胞1×106個(gè)/0.2 ml。每天觀察小鼠成瘤情況。鹽水處理組:按EPO用法和用量腹腔內(nèi)注射生理鹽水。EPO處理組:于第5天觀察到小鼠成瘤后，腹腔注射EPO 60 U/kg，每周3次，連用2周，其用法和用量參考文獻(xiàn)[5]。正常對照組:不做任何處理。每天觀察小鼠的一般狀況。

1.2.3 小鼠外周血中RBC、Hb、Hct和WBC的測定于停藥后次日，將各組小鼠摘眼球放血，EDTA抗凝，應(yīng)用 ACTdiff2血細(xì)胞分析儀測定外周血中RBC、Hb、Hct和 WBC 含量。

1.2.4 EPO對小鼠脾臟臟器指數(shù)的影響 取血后將各組小鼠處死，準(zhǔn)確稱量動(dòng)物體重、脾臟重量，按公式計(jì)算脾臟臟器指數(shù)。脾臟臟器指數(shù)(Spleen index，SI)=脾臟重量(mg)/體重(g)。

1.2.5 小鼠脾臟T細(xì)胞亞群的檢測 將各組小鼠處死后，無菌摘取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107ml-1，取0.1 ml于試管中，分別加入熒光標(biāo)記的小鼠抗CD4+和CD8+T單克隆抗體，振蕩混勻，室溫避光放置30分鐘，PBS洗滌后，用流式細(xì)胞儀分析脾淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+T百分率，計(jì)算CD4+/CD8+T比值。

1.2.6 小鼠血清TNF-α和IL-2含量測定 將1.2.3所取血液靜置后離心(3 000 r/min，10分鐘)，取血漿，用ELISA檢測試劑盒測定血清中TNF-α、IL-2的含量，按試劑盒說明進(jìn)行操作。在酶標(biāo)測試儀上測定各樣本492 nm處吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清中細(xì)胞因子的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，各組均數(shù)間比較用單因素方差分析。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 EPO對小鼠外周血中 RBC、Hb、Hct和 WBC的影響 與正常小鼠相比，鹽水處理組小鼠RBC、Hb和Hct水平顯著降低(P＜0.05);與鹽水處理組相比，EPO可有效提高荷瘤小鼠RBC、Hb和Hct水平(P＜0.05)，與正常小鼠相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。三組小鼠外周血中WBC數(shù)量無明顯差異(P ＞0.05，表1)。

2.2 EPO對小鼠脾臟臟器指數(shù)的影響 EPO處理組和鹽水處理組荷瘤小鼠的脾臟重量較正常對照組增加，脾臟臟器指數(shù)明顯高于正常小鼠(P＜0.05)。EPO處理組小鼠的脾臟臟器指數(shù)明顯高于鹽水處理組(P ＜0.05，表1)。

2.3 EPO對小鼠脾T細(xì)胞亞群的影響 鹽水處理組及EPO處理組荷瘤小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+T比值明顯低于正常小鼠(P＜0.05)，EPO處理組與鹽水處理組相比，CD4+T小鼠脾細(xì)胞百分率無差別(P＞0.05)，CD8+T細(xì)胞百分率下降(P＜0.05)，CD4+/CD8+T比值升高(P＜0.05，圖1和表2)。

2.4 EPO對小鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響 鹽水處理組及EPO處理組荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2含量明顯低于正常小鼠(P＜0.05)，鹽水處理組及EPO處理組荷瘤小鼠血清中TNF-α含量無差別(P＞0.05)，EPO處理組小鼠血清中IL-2水平與鹽水處理組相比明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05，圖2)。

表1 EPO對荷瘤小鼠外周血中RBC、Hb、Hct和WBC及脾臟臟器指數(shù)的影響Tab．1 Effects of EPO on levels of RBC，Hb，Hct and WBC in peripheral blood and spleen index in tumor-bearing mice

圖1 EPO對小鼠脾T細(xì)胞亞群的影響Fig．1 Effects of EPO on T cell subsets of mice spleen analyzed by FCM

表2 EPO對小鼠脾T細(xì)胞亞群的影響Tab．2 Effects of EPO on T cell subsets of mice spleen

圖2 EPO對小鼠血清中TNF-α和IL-2含量的影響Fig．2 Effects of EPO on TNF-α and IL-2 level in serum from mice

3 討論

促紅細(xì)胞生成素是治療腎性貧血的首選藥物，近年來用于腫瘤相關(guān)性貧血的治療也取得較好的效果[6]。近來研究發(fā)現(xiàn)，EPO及EPOR廣泛分布在非紅細(xì)胞類型的細(xì)胞上[7]。不但對血液系統(tǒng)，而且對免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等均有影響[3，4，8-10]。本實(shí)驗(yàn)采用 C57BL/6 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16皮下移植瘤模型，從脾臟重量的變化、T細(xì)胞亞群分布、細(xì)胞因子分泌等方面研究EPO對小鼠免疫功能的影響。

本研究結(jié)果顯示，鹽水處理組荷瘤小鼠外周血RBC、Hb和Hct水平比正常對照組顯著降低;與鹽水處理組相比，EPO可有效提高小鼠外周血RBC、Hb和Hct水平，與正常對照組相比無差別。但EPO并未顯著影響小鼠外周血中WBC的數(shù)量，三組小鼠外周血中WBC的數(shù)量沒有明顯差別。荷瘤小鼠脾臟重量較正常對照組增加，脾臟臟器指數(shù)明顯高于正常小鼠。EPO處理組小鼠的脾臟臟器指數(shù)較鹽水處理組增高，可能與其提高血液中RBC、Hb和Hct有關(guān)。

T細(xì)胞是構(gòu)成免疫防御系統(tǒng)的重要因素，也是機(jī)體抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答的主體，包括CD4+輔助性T細(xì)胞和CD8+抑制性T細(xì)胞兩個(gè)主要亞群，CD4+T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)活性、分泌細(xì)胞因子的作用，處于整個(gè)腫瘤免疫的核心位置，而CD8+T細(xì)胞則有免疫抑制和細(xì)胞毒性作用，二者相互變化、協(xié)調(diào)以維持機(jī)體的免疫平衡。本研究結(jié)果顯示，EPO對荷瘤小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞百分率無影響，EPO處理組荷瘤小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞百分率與鹽水處理組相比下降，致使CD4+/CD8+T比值水平升高。提示EPO可通過下調(diào)CD8+T細(xì)胞百分率而影響荷瘤小鼠的免疫功能。

細(xì)胞因子(Cytokine)是一類由活化的免疫細(xì)胞和相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞分泌，能作用于分泌細(xì)胞本身或其他細(xì)胞的生物活性物質(zhì)，可參與機(jī)體的多種免疫調(diào)節(jié)，激發(fā)宿主對腫瘤的免疫反應(yīng)，并可直接抑制惡性腫瘤的生長，在機(jī)體抗腫瘤免疫中具有重要意義[11，12]。TNF-α 是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，產(chǎn)生于巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，在腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用[13]。IL-2是細(xì)胞免疫應(yīng)答所必需的細(xì)胞因子，通過多種途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14，15]。IL-2主要由抗原激活的T細(xì)胞(主要是CD4+T亞群)產(chǎn)生，可促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)增殖與分化，激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞。近幾年來，IL-2還作為一種免疫制劑，在臨床上用于治療黑色素瘤，取得了一定效果;TNF-α及IL-2二者具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)[16]。結(jié)果顯示，EPO沒有顯著影響荷瘤小鼠血清中TNF-α含量，但EPO處理組小鼠血清中IL-2水平與鹽水處理組相比明顯增高。表明EPO有可能通過促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2，以改善機(jī)體免疫功能，從而提高機(jī)體對腫瘤的特異性免疫應(yīng)答。

綜上所述，黑色素瘤可引起小鼠外周血RBC、Hb、Hct水平和免疫功能的下降，應(yīng)用EPO在改善荷瘤小鼠貧血狀態(tài)的同時(shí)，又可通過改變血清中細(xì)胞因子的含量和血中T淋巴細(xì)胞亞群的比例來增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能。

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