聞一鳴 徐金亭 向軍儉

(廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室 暨南大學(xué)抗體工程研究中心，廣州510632)

免疫磁珠富集技術(shù)，是以磁性微球作為固相表面，結(jié)合免疫學(xué)方法建立起的一門具有重要應(yīng)用前景的樣品富集手段。具有磁性的微顆粒通過結(jié)合特定抗體，在液相中能特異性地與相應(yīng)抗原結(jié)合，依靠磁場的作用力快速地使所需樣品量得到大大的濃縮。由于免疫磁珠富集法具有快速及特異性強的特點，在三十余年的發(fā)展中，已廣泛應(yīng)用于分離及濃縮特定細胞、微生物、蛋白質(zhì)和核酸片段等肉眼難以觀察或樣品中含量不高的物質(zhì)。其應(yīng)用也隨著各個科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展而日趨全面和深入[1]。隨著抗體技術(shù)的發(fā)展，免疫磁珠富集技術(shù)已成為細胞分選和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)支持。除此，鑒于免疫磁珠富集法有助于降低原有檢測手段的檢測限，其應(yīng)用于食品致病微生物和環(huán)境、食品中小分子毒害物的檢測將大有發(fā)展前景。

1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu)、功能與制備方法

1.1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu) 免疫磁珠是一種大小均一，表面具有特定化學(xué)基團的磁性微球。從結(jié)構(gòu)上來說，它分為三部分，核心部分由磁性物質(zhì)構(gòu)成，如γ-Fe2O3、Fe3O4和 MeFe2O3，使磁性微球在磁場作用下能快速聚集;外層由聚苯乙烯、聚乙烯亞胺或聚丙烯酸等高分子材料包裹，保證磁性的密封性良好，不易出現(xiàn)漏磁現(xiàn)象;微球表面還覆蓋有特殊的活化基團，常見的化學(xué)基團有羧基、氨基、巰基、甲苯磺酸基和環(huán)氧基等，能通過共價結(jié)合抗體蛋白上的氨基或羧基基團。近年來，一些商業(yè)機構(gòu)還開發(fā)了表面具有特殊蛋白的磁性微球，如表面具有經(jīng)基因工程改造的A蛋白或G蛋白的磁珠，這些磁珠對普遍抗體Fc區(qū)具有高親和力，能藉此偶聯(lián)抗體的恒定區(qū);又如表面具有鏈霉親和素的磁珠，能與生物素化的抗體緊密結(jié)合，高效地把抗體固定在微球表面。

1.2 免疫磁珠的功能 免疫磁珠的功能主要是通過表面的特異性抗體，在流體力學(xué)作用下，與液態(tài)中的相應(yīng)抗原結(jié)合，并通過多次的磁分離作用，使目的抗原與其余雜質(zhì)徹底分離，從而得到高度濃縮的抗原。根據(jù)磁珠表面偶聯(lián)的不同抗體，免疫磁珠能在短時間內(nèi)富集各種類型的抗原，如分子量極小的核酸、小分子毒素、特異性蛋白、細胞或致病微生物。這種結(jié)合了物理學(xué)、生物學(xué)和免疫學(xué)的濃縮技術(shù)，使樣品的前處理過程變得簡單，且重復(fù)性較高。

1.3 免疫磁珠的制備 針對擬富集的物質(zhì)制備合適的免疫磁珠，是達到有效富集的關(guān)鍵所在，也是采用免疫磁珠富集技術(shù)的難點所在。一般來說，制備免疫磁珠的過程需要關(guān)注磁性微球的大小、表面活化基團、抗體的選擇和偶聯(lián)量、封閉及保存等方面[2，3]。

1.3.1 磁珠的選擇 對于磁珠的挑選，一般是針對其粒徑和表面活化基團進行選擇。磁珠的粒徑一般在納米至微米水平，國外常見的商業(yè)用磁珠大小一般在1～4.5 μm之間，屬于體積較大的磁珠，磁性較好，能通過外層大量的活性基團偶聯(lián)抗體，從而結(jié)合體積相當?shù)母患a(chǎn)物聚集到磁場下，實現(xiàn)細胞、病原微生物及其他微米級顆粒的分選和富集[4，5]。而納米級的免疫磁珠每單位重量具有更大的表面積，分散性更好，對磁場的反應(yīng)性極敏捷，適用于醫(yī)學(xué)診斷、治療和高通量分析[6]。

免疫磁珠的制備實質(zhì)上是磁珠表面的活性基團與抗體外部的氨基的結(jié)合過程，這種結(jié)合可以是共價的，也可以是非共價的結(jié)合。當抗體與表面帶有羧基、氨基、巰基、甲苯磺酸基和環(huán)氧基等基團的磁珠結(jié)合[6]，則形成較為牢固的共價連接，不容易解離;但這類基團在偶聯(lián)抗體的過程沒有靶向性，會無可避免地結(jié)合在抗體的Fab區(qū)，降低免疫磁珠制備后的富集效果。相反，具有偶聯(lián)靶向性的一些表面活化基團，如A蛋白和G蛋白，能通過非特異性吸附抗體Fc區(qū)，把抗體靶向吸附在磁珠表面，并暴露出與抗原結(jié)合的Fab區(qū);鏈霉親和素活化的磁性微球，則能通過偶聯(lián)Fc區(qū)標有生物素的抗體，同樣達到靶向偶聯(lián)的目的。當然，這種通過非共價結(jié)合的偶聯(lián)方式?jīng)]有共價連接的穩(wěn)定性高，在偶聯(lián)過程可通過加入交聯(lián)劑增強偶聯(lián)的穩(wěn)定性。

1.3.2 抗體的選擇及滴度 用于制備免疫磁珠的抗體可以是單克隆抗體也可以是多克隆抗體，單抗對于目的抗原的特異性較好，利于富集后直接用于檢測或分選細胞[7];多抗的親和力往往高于單抗，易于捕獲抗原，但由于其表位較多，對于富集抗原后的處理，較單抗復(fù)雜。有關(guān)抗體的滴度，一般以ELISA測定結(jié)果為參照，但值得注意的是，磁性微球作為固相載體具有立體結(jié)構(gòu)，比酶標板孔的表面積大得多，更利于抗原抗體反應(yīng)，因此在磁珠偶聯(lián)抗體過程中，可以適當降低抗體的偶聯(lián)濃度。

1.3.3 偶聯(lián)的條件 抗體與磁珠偶聯(lián)的條件主要是指偶聯(lián)時緩沖液的體系、pH、溫度和反應(yīng)時間等反應(yīng)條件。緩沖液的體系主要依據(jù)磁珠表面活化基團的特點進行選擇，一般選擇離子濃度較低的緩沖體系，并加入0.5%吐溫-20以減少磁珠聚集現(xiàn)象[8];緩沖液pH通常在pH5～pH9.5之間，過酸或過堿都會影響抗體的活性，不建議采用。對于反應(yīng)溫度、時間和環(huán)境，常作為相關(guān)因素考慮。反應(yīng)溫度越低，偶聯(lián)時間越長[9]，常見的反應(yīng)條件是4℃過夜、室溫反應(yīng)3小時或37℃ 1小時。除此，偶聯(lián)的過程必須保持磁珠的良好分散性，為此可以把磁珠置于渦旋攪拌器或旋轉(zhuǎn)儀，防止磁珠的聚集。

1.3.4 免疫磁珠的封閉與保存 制備后的免疫磁珠表面仍存在較多未結(jié)合抗體的位點，因此需要以一些不與抗原反應(yīng)的小分子把表面活性位點封閉，以減少富集過程中的非特異性吸附。常用的封閉劑有BSA、吐溫-20、明膠和甘氨酸。由于BSA和明膠顆粒較其他封閉劑的分子量大，并且在封閉過程會在磁珠表面形成疏水表面，因此適合用于封閉較大的疏水性磁珠，而吐溫-20與甘氨酸則適用于封閉親水性的小磁珠。

2 免疫磁珠富集技術(shù)的優(yōu)勢

2.1 操作步驟簡單省時 在磁場作用下，磁珠-抗體-抗原復(fù)合物能在數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)在磁場中聚集，通過去除上清及適當洗滌，便可把抗原高效富集(如圖1)，其操作步驟極為簡單，對于試劑、設(shè)備及實驗條件的要求不高，適用于一般實驗室與科研機構(gòu)。與離心、過濾或膜分離等傳統(tǒng)樣品分離程序相比，磁分離技術(shù)利用磁珠作為固相載體，能在同一試管內(nèi)完成擬富集物質(zhì)的分離和洗滌;同樣地，對比液相色譜儀等大型儀器，磁分離也凸顯了其對于設(shè)備要求上的簡便[2]。

圖1 免疫磁珠富集技術(shù)流程圖Fig．1 The procedure of immunomagnetic enrichment technique

2.2 磁珠富集過程高保真 以往常采用離心分離富集、有機溶劑萃取和親和層析等方式對樣品進行提純，對于樣品的活性均存在一定程度的破壞，而且純化的效率也未必很高[9]。離心技術(shù)濃縮樣本是根據(jù)提取物和溶液中其余物質(zhì)存在密度差，從而通過調(diào)整轉(zhuǎn)速分離出提取物。然而，對于成分復(fù)雜的樣品，該方法存在較大的缺陷，除此，離心后的沉淀與上清液難以通過吸取而徹底分離。有機溶劑萃取法則利用不同組分之間溶解度不同的特點進行分離，然而對于成分復(fù)雜的樣品，該方法仍需要先進行樣品預(yù)處理，保證溶液的組分較單一，便于萃取。親和層析法常用于純化蛋白質(zhì)，樣品能通過上柱及洗脫能獲得特異性純化，但偏酸或偏堿性的洗脫環(huán)境往往容易對蛋白質(zhì)的活性造成影響。相比之下，通過磁場作用濃縮樣品的免疫磁珠富集法能使所需物質(zhì)高度濃縮，并且在富集過程，不破壞其生物學(xué)活性。

2.3 高特異性富集 免疫磁性微球表面覆蓋著針對目的抗原的特異性抗體，在液相中能特異性識別抗原表位，并形成抗原抗體復(fù)合物，通過磁聚集與無關(guān)雜質(zhì)分離，并在數(shù)次洗滌中得到純度較高的目的抗原。過去常使用葡聚糖凝膠過濾層析分離并純化樣品中某成分，把分子量在一定范圍內(nèi)的物質(zhì)通過葡聚糖截留，并以鹽離子競爭洗脫，從而收集目的產(chǎn)物。該方法盡管也能起到富集效果，但無可避免地保留著分子量相近的雜質(zhì)。相反，免疫磁珠富集法進一步把富集的純度提升，充分發(fā)揮了免疫學(xué)方法的高特異性優(yōu)勢。

2.4 有助于提高檢測限 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)、免疫熒光和PCR核酸擴增法是常用于檢測微量物質(zhì)的方法，如水樣中的寄生蟲、食物樣品中的致病菌含量和樣品中的病毒含量等[10-15]。然而，盡管這類檢測方法已經(jīng)達到較高的靈敏度，但對于樣品中濃度極低的檢測物，仍然需要建立一套靈敏度更高的檢測方法。鑒于免疫磁珠富集技術(shù)能從上游的樣品前處理步驟中使目的檢測物濃度大大提高，從而間接地降低了整套檢測方法的檢測限。因此，一系列依靠免疫磁珠富集樣品，并結(jié)合各種檢測技術(shù)的高靈敏檢測方法應(yīng)運而生，使檢測限得以有效降低兩個數(shù)量級或以上[16，17]。

3 免疫磁珠的主要應(yīng)用領(lǐng)域

3.1 細胞分選及藥物靶向治療 免疫磁珠富集法最早被應(yīng)用于細胞分選領(lǐng)域，主要有陽性篩選富集和陰性篩選富集法。根據(jù)目的細胞表面的特定表面抗原(如抗原CD3、CD24等)，以標記有相應(yīng)特異性抗體(如抗CD分子的抗體)的磁性微球，從樣品中富集目的細胞的方法為陽性篩選富集法;相反，用特異性免疫磁珠除去樣品中非目的細胞的方法即陰性篩選富集法，兩種方法均可根據(jù)樣品應(yīng)用目的的不同富集所需的細胞。利用磁場分離純化細胞的方法，可處理血液、骨髓、食物、水樣或土樣等生物類粗提液中的細胞，且通過這種方法富集的細胞依然保持良好的生物學(xué)活性，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，而在癌癥的鑒定和治療方面應(yīng)用更是尤為廣泛[18]。

磁性細胞分選器(Magnetic-assisted cell sorting，MACS)是根據(jù)免疫磁珠富集的原理制成的一種有效進行細胞分選的新儀器，Tucker等[19]成功應(yīng)用該技術(shù)富集同源的背根神經(jīng)細胞，Marek等[20]利用CD11b微珠捕獲樣品液中的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，也得到了高純度的目的細胞。MACS也被用于協(xié)助檢測早期肺癌，通過偶聯(lián)有抗CD14與CD16抗體，免疫磁珠能除去痰液中的巨噬細胞和中性粒細胞，使支氣管上皮細胞的純度從1.1%提升到40%，從而成為理想的樣品檢測物[21]。結(jié)合MACS和流式細胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)，也能富集并檢測胃癌細胞，從而判定患者是否罹患胃癌[22]。磁性的藥物靶向治療以納米微球作為載體，對于癌癥治療具有很好的前景。

目前，結(jié)合了免疫磁珠富集技術(shù)的藥物靶向治療在腫瘤診斷和治療上，具有很好的發(fā)展前景。該治療手段以納米微球為載體，既使患者免受化療帶來的副作用，又提高了治療的效果[23，24]。磁珠和藥物結(jié)合后，在生物機體內(nèi)，能通過外在的磁場作用，準確地完成藥物在體內(nèi)的空間定位，使藥物聚集到理想作用位點;同時，由于藥物在磁場作用下得到富集，則可減少藥物注入劑量，從而減少藥品的毒性副作用[25]。單克隆抗體常作為靶向藥物偶聯(lián)在納米顆粒上，進入機體后通過抗原抗體反應(yīng)形成復(fù)合物，促使靶細胞被免疫細胞吞噬或誘導(dǎo)細胞凋亡，是先進治療癌癥的有效方法之一。用于藥物靶向治療的納米磁珠由于體積較小(常在10～100 nm之間)，能順利通過通透性較強的新生血管，從而直達腫瘤位置并留滯[1]。顯然，免疫磁珠富集技術(shù)為體內(nèi)靶向治療打下了良好的基礎(chǔ)，但該技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的進一步發(fā)展，仍有賴于更多安全、穩(wěn)定且有效的抗體藥物的成功研制。

3.2 病原微生物的檢測 病原微生物廣泛存在于肉類、乳制品及水樣等物質(zhì)中，對于這些肉眼難發(fā)現(xiàn)的微生物，樣品的前處理是至關(guān)重要的，免疫磁珠富集法與離心、有機溶液萃取和親和層析等傳統(tǒng)樣品前處理方法相比，不僅快速簡單，還提高了檢測的可靠性和靈敏性，因此廣泛應(yīng)用于眾多類型的食品檢測和環(huán)境中的水樣和土壤檢測。

Lee等[26]應(yīng)用免疫磁珠富集法，建立了一種快速檢測淡水和海水水質(zhì)的方法。他們以大腸桿菌和腸球菌含量為檢測指標，通過相應(yīng)抗體共價偶聯(lián)羧基活化的磁珠制成免疫磁珠，捕獲水樣中的大腸桿菌或腸球菌，然后通過裂解細胞釋放出菌體中的ATP，借助熒光素與ATP的顯色反應(yīng)鑒別樣品中是否含有目的菌體。Yang[27]結(jié)合納米磁珠及實時定量PCR技術(shù)，建立了快速檢測營養(yǎng)肉湯和奶制品中單增李斯特菌的一種檢測手段。在實驗中，研究人員通過針對單核細胞增生李斯特菌的兔屬多抗偶聯(lián)納米磁珠，使樣品中的菌液得到濃縮，再設(shè)計針對該菌的特異性引物，利用實時定量PCR把富集后的樣品進行核算擴增，最終以CT值(Threshold cycles)反映菌含量。該方法能檢測到0.5 ml樣品中含有的≥102個菌落，靈敏度甚高。上述兩種利用免疫磁珠富集法的檢測手段，依然需要對樣品進行前增菌處理，但經(jīng)過磁珠富集，增菌的時間從原來的需時2～3天，縮短為18～24小時，大大提高了檢測的速度，有利于實際應(yīng)用的推廣。對于腸梨硅蟲胞囊、分支桿菌和沙門氏菌等致病菌[28-30]，也可通過磁珠富集法提升整體檢測速度及靈敏度。Lien等[31]以免疫磁珠微流體用于快速檢測甲型流感病毒。其操作較為簡便，只需把帶有藻紅蛋白(一種熒光素)的抗甲型流感病毒的單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)，制備成免疫磁珠后捕獲樣品中的病毒顆粒，然后通過光學(xué)儀器檢測樣品的光強，從而判斷樣品中有無病毒。與只使用流式細胞術(shù)的檢測手段相比，該方法靈敏度高出1 024倍，并且整個檢測能在15分鐘內(nèi)完成，對比其他方法具有無可比擬的優(yōu)勢。

此外，免疫磁珠富集法還廣泛應(yīng)用于病毒檢測當中，它使核酸在提取的過程中免受干擾酶(如RNA酶)和其他雜質(zhì)的影響，確保樣品處理過程的高保真[31]。Willis等[32]結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)及實時定量PCR，檢測牛肉中大腸桿菌O157:H7的含量，該方法較只使用Real-time PCR的靈敏度更高。有研究比對了六種不同的隱孢子蟲DNA提取方案，發(fā)現(xiàn)了采用免疫磁珠富集法提取的核酸片段，經(jīng)過PCR及電泳鑒定后，條帶最清晰，且陽性率最高[33]。

3.3 小分子抗原的濃縮 免疫磁珠富集技術(shù)可應(yīng)用于濃縮一些半抗原小分子物質(zhì)的富集，如水樣或食品中的毒素和重金屬等危害物。據(jù)報道，特異性的免疫磁珠能富集蓖麻毒素，借助光譜學(xué)技術(shù)，在20分鐘以內(nèi)便可檢測出存在于牛奶中的蓖麻毒素，檢測限達到 4 μg/ml[34]。Yang 等[35]制備了表面偶聯(lián)有抗氯霉素的磁性微球，成功地從蝦樣品中提取出氯霉素。該項研究通過儀器分析免疫磁珠與抗原結(jié)合后的磁性減少量，從而判斷抗原的結(jié)合率，更直觀地展現(xiàn)了免疫磁珠的富集優(yōu)勢。目前，有關(guān)免疫磁珠用于富集小分子物質(zhì)的研究仍不多見，主要是因為制備相關(guān)抗體難度較大且研發(fā)周期較長。鑒于近年來有關(guān)小分子毒物的污染事件愈發(fā)突出，許多科研機構(gòu)已研發(fā)出針對毒素或各類重金屬的高效價抗體[36-38]，為免疫磁珠富集技術(shù)在這領(lǐng)域的應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。

3.4 蛋白質(zhì)分析 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的興起，免疫磁珠富集手段更多地被用于尋找并富集特定細胞株里的生物標記物。這些在細胞上清中含量較低的蛋白質(zhì)，能被偶聯(lián)了特異性抗體的磁珠捕獲，并通過質(zhì)譜分析鑒定。Aqai Payam等[39]利用超順磁性微球偶聯(lián)單克隆抗體，對存在于谷物中的真菌毒素蛋白進行分選，并結(jié)合液相色譜技術(shù)準確檢測。通過免疫磁珠富集技術(shù)，初始含量極低的生物標記物得以高效濃縮并通過質(zhì)譜被鑒定出來。Nylandsted等[40]利用免疫磁珠濃縮技術(shù)純化溶酶體，比較正常狀態(tài)下和癌癥狀態(tài)下溶酶體的性質(zhì)差異，從而發(fā)現(xiàn)了原癌基因ErbB2的異位表達，導(dǎo)致了溶酶體膜蛋白質(zhì)組發(fā)生顯著性差異，最終使癌細胞高度擴散。Careri等[41]則把免疫磁珠富集方法應(yīng)用于收集樣品中濃度較低的花生過敏原蛋白，他們利用表面連有Protein A的磁性微粒偶聯(lián)特異性單抗，直接從樣品中富集到抗原Ara h3/4花生蛋白。

4 展望

免疫磁珠的發(fā)展至今已30余年，在眾多科研工作者的努力下，免疫磁珠的應(yīng)用日漸廣泛及成功。國外商業(yè)用的免疫磁珠生產(chǎn)已走向穩(wěn)定化和多元化發(fā)展，科研單位也能根據(jù)自身需要，采用化學(xué)方法合成所需的免疫磁珠。

目前，對于免疫磁珠的制備已有較為豐富的理論及實踐依據(jù)，但抗體在偶聯(lián)磁珠后活性、親和力和效價有所降低往往會影響下游技術(shù)應(yīng)用的效果，成為制約此富集技術(shù)應(yīng)用的一個關(guān)鍵因素。因此，優(yōu)化免疫磁珠制備方法，確?？贵w偶聯(lián)后保持良好活性和親和力是應(yīng)用此項富集技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。除此，免疫磁珠在捕獲抗原后，如何有效地解吸附，順利進入下一環(huán)節(jié)的應(yīng)用也是免疫磁珠富集技術(shù)在結(jié)合其他領(lǐng)域技術(shù)時所要關(guān)注的。

免疫磁珠富集技術(shù)所具備的特異性強、快速、操作簡便及重復(fù)性強等多個優(yōu)勢必將給科研帶來更多的便捷，過去在細胞分選領(lǐng)域的應(yīng)用已得到廣泛的成功，并為眾多科研機構(gòu)所推行。今后，免疫磁珠富集技術(shù)將更多地應(yīng)用于病原微生物檢測、藥物靶向治療、分子生物學(xué)領(lǐng)域及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，對于已有的樣品檢測方法及生物醫(yī)學(xué)的藥物研究注入新的動力。

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