孫黎飛 孫志宏 吳強強 張曉席 杜延會 王桂臣

(解放軍第148醫(yī)院腫瘤中心，淄博255300)

隨著對風(fēng)濕免疫性疾病的認識和研究不斷提高，風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細胞減少(Rheumatism immune-related hematocytopenia，RIRH)的發(fā)病率也逐年增高。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，部分RIRH患者伴有血清HLA-B27升高，且端粒酶活性增強，較之血清HLAB27陰性者造血細胞損傷更加嚴(yán)重[1，2]，在血清 IgG升高的患者骨髓中伴有不同造血細胞島出現(xiàn)[3]。本文進一步觀察了該類患者血清中炎性因子的含量和骨髓中免疫細胞表達炎性因子的狀態(tài)，探討其與RIRH骨髓造血細胞損傷的關(guān)聯(lián)和臨床診療的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 66例RIRH為2009年～2012年我院診治患者，男性20例，女性46例，年齡范圍36～72歲;全血細胞減少32例，兩系減少34例。外周血WBC(0.7～3.2)×109L-1，HB(35～102)g/L，PLT(30～238)×109L-1;其中伴有干燥綜合征者19例，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎30例，風(fēng)濕性心臟病17例。27例WBC＜2.0×109L-1，伴肺部或尿路感染者血清IgG和血沉(ESR)顯著增高。21例間斷服用糖皮質(zhì)激素，28例伴血清HLA-B27增高(影像學(xué)排除強直性脊柱炎)。血清對照組30人選自我院查體中心健康標(biāo)本，年齡20～50歲，男性15人，女性15人。

1.2 主要試劑和器材 血清 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17和IFN-γ酶免(ELISA)檢測試劑盒購自美國RD公司，羊抗人HLA-DR單克隆抗體購自美國Beyotime公司，羊抗人IgG抗體、驢抗羊IgG熒光二抗(Cy3)、小鼠抗人FcγⅡR、羊抗小鼠IgG熒光二抗(FITC)、小鼠抗人甘露糖受體(Mannose receper，MR，PE)、ICAM-1(PE)、IL-12(AF488)、IL-17A(FITC)和IL-17RA(PE)單克隆免疫熒光(Immunofluorescence，IF)抗體均購自美國SANTA公司。

1.3 檢測血清細胞因子含量 留取患者空腹靜脈血清，-80℃保存，1周內(nèi)ELISA方法檢測其治療前后血清 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17 和 IFN-γ 含量，每孔標(biāo)本設(shè)3孔，波長450nm讀取3孔OD均值，標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品濃度。

1.4 分析骨髓免疫細胞活化狀態(tài)和免疫分子表達留取患者治療前和治療4周后骨髓涂片，聯(lián)苯胺法過氧化物酶(Peroxydase，POX)染色，觀察免疫細胞POX活性;免疫化學(xué)(IC)法檢測免疫細胞HLADR抗原表達，IF法檢測骨髓細胞抗人IgG抗體、FcγⅡR、MR、ICAM-1、IL-12、IL-17A 和 IL-17RA 等免疫分子表達，缺鐵性貧血骨髓片為疾病對照。

1.5 藥物治療原則

1.5.1 免疫抑制劑和對癥支持 ①根據(jù)患者病情予以糖皮質(zhì)激素治療，誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡，抑制免疫細胞活化;至血象恢復(fù)后，逐漸遞減;血清HLA-B27和血清IgG升高者，及時聯(lián)合環(huán)孢素A(CsA)口服，抑制T輔助細胞活化。②伴有感染灶，發(fā)熱、WBC顯著下降者，根據(jù)藥敏選擇抗生素和(或)聯(lián)合抗病毒藥物治療。③原發(fā)病和對癥支持治療。

1.5.2 復(fù)方丹參干預(yù)改善骨髓血管炎性病變 32例血小板計數(shù)＞50×109L-1，無出血傾向者在上述治療方案同時聯(lián)合復(fù)方丹參(四川和升制藥)30 ml/qd靜滴，促進患者體內(nèi)和骨髓造血微環(huán)境炎性因子的清除，隨機抽取未加復(fù)方丹參治療組30例RIRH作為治療對照組，兩組年齡范圍、性別比例和病情基本相似。每周復(fù)查兩組患者血清IL-5和IL-17含量及外周血象，4周后隨訪兩組骨髓象變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RIRH患者血清中多種炎性因子升高 患者入院時血清 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17 和 IFN-γ 分別為(126.04±7.66)ng/L、(316.23±25.163)ng/L、(328.43±27.01)ng/L、(48.17±4.22)ng/L和(40.28±3.69)ng/L，較之對照組顯著升高，P值均＜0.05。經(jīng)藥物治療4周至血象恢復(fù)時，上述細胞因子分別下降至(58.21±5.14)ng/L、(188.13±12.51)ng/L、(96.01±6.76)ng/L、(26.01±4.23)ng/L和(9.13±2.55)ng/L，接近對照組(詳見表1)，P＞0.05。66例患者中IL-5和IL-17升高率為100%(66/66)，IL-12 升高率為 97.0%(64/66)，而IL-10和 IFN-γ升高率分別為66.67%(44/66)和69.69%(46/66)，較前者差異顯著，P＜0.05。

2.2 RIRH患者骨髓免疫細胞活化特點

2.2.1 組織嗜堿細胞(肥大細胞，Mast cell，MC)增多與IL-10升高密切相關(guān) 患者骨髓中MC數(shù)量增多，分類約為(3.2±0.08)%，顯著高于疾病對照組(0.6±0.05)%，P＜0.05;活化的MC通過粘附、捕獲和釋放嗜堿性顆粒攻擊病變血細胞(圖1 A～D)，且與血清IL-10升高水平密切相關(guān)r=0.885。

2.2.2 嗜酸性粒細胞(Eosinophile granulocyte，EOS)增生活躍 患者骨髓中EOS分類約為(7.4±3.1)%，高于對照組(2.4±1.6)%，P＜0.05?；罨腅OS特異性顆粒POX活性增強，粘附、捕獲和吞噬著病變的中性粒細胞(圖1E)、血小板(圖1F箭頭)和紅細胞(圖1G箭頭)，被攻擊的病變中性粒細胞POX活性顯著減弱(圖1H箭頭)。

2.2.3 巨噬細胞(Mφ)形態(tài)奇異 部分患者由于間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，其骨髓中POX陽性形態(tài)怪異的Mφ(圖2A～C)多見，伴有感染者骨髓中可見到巨大活化狀態(tài)的Mφ募集各種炎性細胞現(xiàn)象(圖2D)。

2.2.4 伴有感染者免疫細胞高表達HLA-DR 活化狀態(tài)的 DC(圖2E)、Mφ(圖2F)和 MC(圖 2G)HLA-DR呈強陽性表達。伴感染者骨髓造血細胞島中高表達HLA-DR的巨大Mφ捕獲病變血細胞現(xiàn)象多見(圖2H)。間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療者，骨髓中約1/2的DC、Mφ不表達HLA-DR。

2.2.5 RIRH患者骨髓中免疫細胞捕獲表達抗人IgG病變血細胞現(xiàn)象多見 部分病變的血細胞膜抗人IgG IF呈帶狀陽性，EOS(圖2A)和MC(圖2B)特異性顆粒結(jié)合大量抗人IgG IF，活化的DC(圖2C)和Mφ粘附捕獲病變血細胞現(xiàn)象多見;血清IgG顯著升高者骨髓中，造血細胞島中Mφ與病變血細胞連接處大量抗人IgG IF沉積(圖2D)，對照組骨髓造血細胞膜抗人IgG IF陰性。

2.2.6 RIRH患者骨髓中活化的免疫細胞高表達FcγⅡR 缺鐵性貧血和間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素患者骨髓中Mφ低表達FcγⅡR(圖3F)，伴有感染血清IgG升高的RIRH患者骨髓中，活化的Mφ表達FcγⅡR的數(shù)量顯著增多(圖3G)，與病變的造血細胞結(jié)合形成巨大的Mφ型造血細胞島多見(圖3H)，提示感染加重造血損傷?；罨腄C不表達FcγⅡR，而EOS則強陽性表達(圖3E)。

2.2.7 RIRH患者骨髓中活化的免疫細胞高表達MR 缺鐵性貧血和間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素患者骨髓中DC和Mφ呈顆粒狀弱表達MR(圖3J)，伴有感染的RIRH患者骨髓中DC(圖3I)、EOS(未顯示)和Mφ(圖3K)表達 MR的數(shù)量顯著增多，在 IgG和ESR升高的全血細胞減少RIRH患者骨髓中，由高表達MR的Mφ與病變血細胞組成的造血細胞島多見(圖3L)，提示造血損傷加重。

表1 細胞因子檢測結(jié)果(ng/L)Tab．1 Serumal level of cytokines(ng/L)

圖1 RIRH患者骨髓中活化的組織嗜堿細胞和嗜酸性粒細胞(×1 000)Fig．1 Activated tissue basophil and eosinophil in bonemarrow of RIRH patients( ×1 000)

圖2 RIRH患者骨髓中奇異的Mφ和免疫細胞HLA-DR表達情況(×1 000)Fig．2 Weird expression of HLA-DR on Mφ and other immunocyte in marrow of RIRH patients( ×1 000)

圖3 RIRH患者骨髓中免疫細胞表達IgG、FcγⅡR和MR(×1 000)Fig．3 IgG，F(xiàn)cγⅡR and MR were observed to be expressed by immunocyte in marrow of RIRH patients( ×1 000)

2.2.8 感染促進粘附分子ICAM-1表達 伴有感染的RIRH患者骨髓中活化的DC(圖4A)、EOS(圖4B)和Mφ(圖4C)高表達粘附分子ICAM-1，缺鐵性貧血與間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的RIRH患者，上述免疫細胞呈顆粒狀弱表達ICAM-1(圖4D)，提示感染可上調(diào)粘附分子表達，促進免疫細胞參與對造血細胞的炎性反應(yīng)過程。

2.2.9 RIRH患者骨髓免疫細胞高表達IL-12和IL-17A及其受體 骨髓中DC(圖4E)、EOS(圖4F)和Mφ(圖4G)胞漿中呈分泌狀表達IL-12，缺鐵性貧血患者骨髓中DC和EOS不/弱表達，Mφ呈灶性弱表達(圖4H)。缺鐵性貧血和血清IgG升高骨髓呈體液免疫活化優(yōu)勢狀態(tài)的RIRH患者骨髓中，DC不表達IL-17A，而在血清HLA-B27升高的RIRH患者骨髓中，活化的DC(圖4I)、EOS(圖4J)和Mφ(圖4K)均高表達IL-17A，缺鐵性貧血患者骨髓中僅少量造血細胞表達IL-17RA，伴有感染的RIRH患者骨髓細胞中廣泛表達IL-17RA(圖4L)，提示感染使IL-17A與IL-17RA結(jié)合的細胞數(shù)量增多，能放大由其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

2.3 藥物治療效果

2.3.1 經(jīng)糖皮質(zhì)激素聯(lián)合抗感染等藥物治療1周后，患者血清IgG和ESR逐漸下降，血象逐漸恢復(fù)直至正常。伴有HLA-B27升高全血細胞減少的RIRH患者血象恢復(fù)遲緩，經(jīng)聯(lián)合CsA治療4周后，患者血象開始恢復(fù);復(fù)查骨髓可見EOS的POX活性減弱，Mφ核凋亡現(xiàn)象多見，2/3的 DC和 Mφ HLA-DR轉(zhuǎn)陰。

圖4 免疫細胞表達ICAM-1、IL-12、IL-17A和IL-17RA(×1 000)Fig．4 ICAM-1，IL-12，IL-17A and IL-17RA were expressed by immunocyte in marrow of RIRH patients(×1 000)

圖5 聯(lián)合復(fù)方丹參治療對患者血清炎性因子清除的動態(tài)觀察Fig．5 The analysis of compound Salvia miltiorrhiza to remove serumal inflammatory factors

2.3.2 復(fù)方丹參聯(lián)合免疫抑制劑治療能促進患者血清炎性因子清除 32例RIRH聯(lián)合復(fù)方丹參治療2周以后，血清IL-5和IL-17含量較之未聯(lián)合復(fù)方丹參組顯著降低(圖5)，血象恢復(fù)時間較之未聯(lián)合復(fù)方丹參組提前1周，骨髓中表達IL-17A和IL-17RA的免疫細胞及造血細胞比例，較之對照組顯著減少。兩組間差異顯著，P＜0.05。

3 討論

風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病是各種致病因素誘發(fā)機體免疫系統(tǒng)對自身成分發(fā)生免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的自身免疫性疾病狀態(tài)。患者體內(nèi)存在針對自身成分產(chǎn)生的自身抗體和/或自身反應(yīng)性T淋巴細胞，能介導(dǎo)對自身細胞或組織成分獲得性免疫應(yīng)答。由于疾病慢性遷延和反復(fù)發(fā)作，以及自身抗體的分子模擬和抗原表位擴展，最終累及造血系統(tǒng)，致使患者體內(nèi)部分血細胞膜抗原結(jié)構(gòu)改變，引發(fā)了針對病變血細胞(靶細胞)的風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細胞減少(RIRH)超敏反應(yīng)病理過程和疾病狀態(tài)，感染免疫活化能加重對造血細胞的免疫損傷作用[4]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，該類患者除伴有自身免疫性疾病外，臨床主要表現(xiàn)為外周血兩系或三系(全血細胞)減少，骨髓增生活躍，組織嗜堿細胞、嗜酸性粒細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等多種免疫細胞活化。部分患者由于間斷服用糖皮質(zhì)激素，骨髓中漿細胞和巨噬細胞形態(tài)異常，功能受抑。而伴WBC減少的患者骨髓中，活化的嗜酸性粒細胞攻擊POX活性減弱或消失的病變中性粒細胞現(xiàn)象增多，是RIRH患者重要的骨髓特征，同時也提示嗜酸性粒細胞在RIRH造血細胞損傷病理過程中，起到至關(guān)重要的作用。

我們的研究結(jié)果顯示，RIRH患者由于長期處于免疫紊亂狀態(tài)，其血清中 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17和IFN-γ等多種與自身免疫相關(guān)聯(lián)的炎性因子升高，其中促進嗜酸性粒細胞增殖的IL-5和作為炎性介質(zhì)的IL-17的升高率為100%，而活化細胞免疫的炎性因子IL-12升高率為97.0%，表明這些介導(dǎo)自身免疫性炎性因子與RIRH造血細胞炎性損傷的病理過程密切關(guān)聯(lián)[5，6]。

我們的研究結(jié)果還顯示，由于患者體內(nèi)存在針對自身病變造血細胞膜的IgG抗體，其骨髓中部分病變血細胞膜抗人IgG IF陽性表達，誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生，由于原發(fā)病導(dǎo)致患者體內(nèi)免疫紊亂狀態(tài)，多種免疫細胞活化，以不同方式攻擊病變血細胞，是RIRH骨髓造血細胞病理性損傷重要的特征。部分患者由于WBC減少和間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，極易并發(fā)感染加重病情?；颊吖撬柚芯奘杉毎缮险{(diào)表達FcγⅡR和 MR，介導(dǎo) ADCC效應(yīng);上調(diào) ICAM-1表達，促進免疫細胞對病變血細胞的粘附、捕獲和吞噬，是患者造血細胞破壞的重要方式[7-9]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，RIRH患者骨髓中，活化的免疫細胞高表達IL-12和IL-17A，提示其可能具有分泌這些炎性介質(zhì)的功能;能通過介導(dǎo)骨髓造血微環(huán)境的血管炎性病變，影響造血細胞的生長發(fā)育，損傷和破壞病變造血細胞，亦為該類患者骨髓造血細胞破壞的另一重要因素。

藥物治療結(jié)果及IL-5和IL-17追蹤分析指標(biāo)表明，在抗感染、應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和CsA等藥物，抑制免疫細胞對造血細胞破壞作用同時，對血小板＞50×109L-1無出血傾向患者，謹慎聯(lián)合復(fù)方丹參等活血化瘀藥物治療，有利于炎性因子的代謝和清除，改善骨髓造血微環(huán)境，促進疾病恢復(fù)。

1 孫黎飛，韓 冰，吳強強 et al.人類白細胞抗原B27在免疫相關(guān)性血細胞減少患者診療中的意義[J].中華內(nèi)科雜志，2012;51(7):557-559.

2 孫黎飛，韓 冰，吳強強et al.免疫相關(guān)性血細胞減少患者骨髓造血細胞端粒酶活性檢測的臨床意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2012;92(36):2530-2533.

3 孫黎飛，韓 冰，李 鋼et al.骨髓造血細胞島在免疫相關(guān)性血細胞減少患者中的異質(zhì)性研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2012;28(5):300-304.

4 何 維主編.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:318-321.

5 Deng I，Younge B R，Olshen R A et al.Th17 and Th1 T-cell responses in gaint cell arterritis[J].Circulation，2010;121:906-915.

6 Ekinici N S.IL-17A has an important role in the acute attacks of Behcet`s disease[J].Rheumatology，2011;50:293-298.

7 Crespo H，Jauregui P，Glaria I et al.Mannose receptor may be involved in small ruminant lentivirus pathogenesis[J].Vet Res，2012;43(1):43.

8 Giraldi-Guimares A，de Freitas H T，Coelho Bde P et al.Bone marrow mononuclear cells and mannose receptor expression in focal cortical ischemia[J].Brain Res，2012;1452:173-184.

9 Liu Z，Ma Y，Moyer M P et al.Involvement of the mannose receptor and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway of the microdomain of the integral membrane protein after enteropathogenic Escherichia coli infection [J].Infect Immun，2012;80(4):1343-1350.