王建杰 閆冬梅 董 航 宋漢君 歐葉濤 商 宇 (佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，佳木斯154007)

90年代在中藥治療宮頸癌、肝癌、肺癌、喉癌、乳腺癌等有效方劑中均含有牡丹皮，為此人們開始研究牡丹皮的抗腫瘤作用[1，2]。丹皮酚 (Paeonol)是牡丹皮中的活性成分。據(jù)報道，丹皮酚對多種腫瘤細胞，如人紅白血病細胞K562、人宮頸癌細胞Hela、肝癌細胞BEL-7404以及大腸癌HT-29細胞的增殖等具有抑制作用，并且報道其抗腫瘤機制為誘導細胞凋亡或提高免疫分子的活性，包括減少Bcl-2與Bax的比值，上調(diào) Fas/FasL蛋白的表達和Caspase-3 的表達，調(diào)節(jié)PTEN/Akt信號通路[3-5]。我們先前的研究表明，丹皮酚能減少乳腺癌小鼠腫瘤組織中p53、Bcl-2以及CerbB-2的表達而抑制腫瘤細胞的生長，從而提示丹皮酚可能通過誘導乳腺癌細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。本研究通過觀察丹皮酚對EMT6乳腺癌小鼠腫瘤組織形態(tài)、凋亡指數(shù)以及凋亡相關(guān)基因的表達，進一步闡明丹皮酚抗乳腺癌的作用及其機制，為傳統(tǒng)中藥治療乳腺癌提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑藥品 丹皮酚來自沈陽藥科大學提純分離，純度 ＞98%。環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)原位凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司。兔抗鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體購自福建邁新生物有限公司。Trizol試劑購于Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄 cDNA合成試劑盒購于大連TaKaRa生物公司，β-actin多克隆抗體來自北京博奧森生物有限公司。

1.1.2 實驗動物和細胞株 雌性昆明種小鼠，體重18～22克，購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心。自由飲水，清潔級動物飼養(yǎng)房，溫、濕度適宜，光照8～10小時/天。小鼠乳腺癌EMT6細胞株購自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及藥物處理 以生理鹽水調(diào)節(jié)小鼠乳腺癌細胞株EMT6濃度至107個/ml，于小鼠右前肢腋下注射0.2 ml/只，共10只，腫瘤長至1 cm時取出，制成5×106個/ml腫瘤細胞懸液，注于小鼠右前肢腋下0.2 ml/只，造模40只，隨機分為4組，于接種24小時后，給予不同的藥物干預(yù)，一組不給予處理作為腫瘤對照組;一組給予CTX(25 mg/kg·d，腹腔注射)作為陽性藥物對照組(CTX組)，其他兩組分別給予丹皮酚低劑量150 mg/kg，高劑量300 mg/kg，腹腔注射，每日1次，連續(xù)14天。每日觀察，隔日稱重。

1.2.2 腫瘤生長抑制率測定 14天后，次日脫頸處死小鼠，剖取瘤塊觀察并稱重，按公式計算小鼠腫瘤生長抑制率:腫瘤生長抑制率(%)=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.2.3 腫瘤組織細胞形態(tài)學的觀察 取各組小鼠腫瘤組織0.5cm×0.5 cm大小置于4%中性福爾馬林固定液中固定，梯度酒精脫水后，石蠟包埋，組織切片機切片，蘇木精、伊紅染色，光鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學變化。

1.2.4 腫瘤組織切片的TUNEL染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟和水合，按照TUNEL試劑盒說明書操作，蘇木精復(fù)染，漂洗脫水，顯微鏡下觀察。鏡下明顯的棕黃色顆粒即是凋亡的細胞，而藍色的細胞提示非凋亡的細胞，圖像采集應(yīng)用Leica圖像分析軟件，陽性細胞的百分數(shù)應(yīng)用Leica QWin軟件進行計算。選擇5個隨機的視野，每個視野計數(shù)100～200個細胞。凋亡指數(shù)按公式計算:凋亡指數(shù)(%)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.5 腫瘤組織中Bcl-2和Bax mRNA表達 應(yīng)用Trizol法對腫瘤組織中的總RNA進行提取。電泳觀察RNA提取結(jié)果。1 μg的總RNA用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA并進行PCR擴增，PCR反應(yīng)總體積 25 μl，Bcl-2、Bax和 β-actin 引物自行設(shè)計合成。Bcl-2引物序列 Forward:5'-CCTGGCACCTGGCGGATAGC-3'; Reverse:5'-CGACTGAAGAGTGAGCCCAGCAGAAC-3'長度529 bp。Bax引物序列Forward:5'-GCTCTGACAGATCATGAAGACAG-3';Reverse:5'-CAATCCAA AGTGGACCTGAGG-3'長度746 bp。β-actin序列 Forward:5'-AATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3';Reverse:5'-CGCCTAGAAGCACTTGCGGTG-3'長度 994 bp。Bcl-2 和Bax反應(yīng)條件:95℃、5分鐘，預(yù)變性;94℃、30秒，變性;58℃、30秒，退火;72℃、40秒，延伸，擴增30個循環(huán)，72℃、10分鐘，終末延伸，4℃保溫。樣品取出后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各條帶，依據(jù)各條帶的光密度和面積對擴增產(chǎn)物進行定量分析，以 β-actin密度作為參考定量標準，計算 Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin 的值。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對小鼠EMT6乳腺癌移植瘤生長的抑制作用 各組小鼠不同藥物處理 14天后，發(fā)現(xiàn)CTX和低、高劑量的丹皮酚對小鼠移植性腫瘤均顯示出明顯的抑制作用。模型對照組小鼠的平均腫瘤重量為2.58克，而丹皮酚治療組和CTX組小鼠平均瘤重分別為1.48(L)、1.23(H)和1.06克(CTX)，比模型對照組明顯減少(P＜0.01);丹皮酚治療組和CTX組的腫瘤抑制率分別是42.64%、52.33%和58.91%。CTX組小鼠體重有所減少，但與對照組相比，無顯著差異(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，CTX與丹皮酚對小鼠EMT6乳腺癌實體瘤具有明顯抑制作用(表1)。

2.2 腫瘤組織的形態(tài)學觀察 小鼠腫瘤組織切片經(jīng)過HE染色后，鏡下觀察顯示，腫瘤細胞在對照組排列緊密，大小不一，形狀各異，胞漿較少，胞核大并深染，以及明顯的異型性和異常增生(見圖1A)。經(jīng)過CTX和丹皮酚處理后，腫瘤細胞數(shù)目明顯減少，核染色質(zhì)聚集于核膜邊緣。核型不規(guī)則，核膜表面粗糙，核碎裂但被核膜包繞，出現(xiàn)凋亡小體，與對照組相比出現(xiàn)更多的凋亡細胞(見圖1B、C)。

表1 丹皮酚對EMT6小鼠的抑制作用(±s，n=10)Tab．1 The inhibitory effect of paeonol on EMT6 solid tumors(±s，n=10)

表1 丹皮酚對EMT6小鼠的抑制作用(±s，n=10)Tab．1 The inhibitory effect of paeonol on EMT6 solid tumors(±s，n=10)

Note:1)P＜0.01，vs control group.

Groups Treatment(mg/kg) Body weight Start End Mean weight of tumor(g) Inhibition rate(%)Control — 19.71±1.84 21.18±2.01 2.58±0.46—52.33 CTX 25 20.96±1.72 19.24±1.20 1.06±0.191) 58.91 Paeonol 150 20.17±1.84 21.65±2.59 1.48±0.241) 42.64 300 20.86±1.74 22.57±2.04 1.23±0.271)

圖1 丹皮酚處理后腫瘤組織形態(tài)學改變 (H＆E，×400)Fig．1 Morphological changes of tumor tissues in the EMT6 model treated with paeonol(H＆E，×400)

圖2 乳腺癌小鼠凋亡形態(tài)學和凋亡指數(shù)變化(×200)Fig．2 Morphological and apoptotic index changes of apoptosis(×200)

圖3 腫瘤組織Bcl-2和Bax mRNA表達Fig．3 Expression of Bcl-2 and Bax in tumor tissues

2.3 腫瘤組織凋亡百分率 應(yīng)用原位凋亡TUNEL染色特異地檢測了各組小鼠腫瘤組織細胞凋亡的情況。光鏡下觀察可見，模型對照組可見腫瘤細胞大多染成藍色，即陰性細胞，僅有少量染成棕黃色的細胞，如圖2A所示。與對照組相比，在CTX組和丹皮酚組腫瘤組織切片中出現(xiàn)了更多明顯的棕黃色顆粒，見圖2B、C。經(jīng)過圖像軟件分析，模型對照組腫瘤細胞凋亡率為4.92%，經(jīng)過CTX和丹皮酚治療后，凋亡率達到9.94%(CTX)、12.37%(L) 和 21.24%(L)。與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 腫瘤組織Bcl-2和Bax mRNA表達 應(yīng)用RTPCR方法檢測了Bcl-2、Bax的mRNA表達。結(jié)果顯示，在模型對照組Bcl-2 mRNA呈過表達，Bax mRNA呈低表達，CTX組和丹皮酚組的Bcl-2 mRNA表達明顯減弱，而Bax表達卻明顯增強(圖3)。與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

3 討論

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，我國的發(fā)病率正以3%的增長速度逐年上升，2011年上海、北京、重慶等地的乳腺癌發(fā)病率占當?shù)嘏詯盒阅[瘤的首位。當前乳腺癌的常用治療手段主要包括傳統(tǒng)的手術(shù)治療以及術(shù)后放化療等，這些手段雖然可以使患者獲得較高的生存率，但是乳腺癌術(shù)后常在幾年內(nèi)復(fù)發(fā)。因此，尋找有效的、副作用小的化療藥物尤其重要。乳腺癌化療藥物的開發(fā)過程中，傳統(tǒng)中藥以其安全性高，副作用小，一直受到患者的青睞，也成為國內(nèi)外眾多醫(yī)學工作者和腫瘤學者研究的方向。

丹皮酚是從牡丹皮中提取出來的小分子酚類物質(zhì)，對多種腫瘤細胞的增殖具有抑制作用，因此本文研究了丹皮酚對乳腺癌的作用和分子機制。實驗結(jié)果表明，丹皮酚能抑制EMT6乳腺癌小鼠腫瘤細胞的增殖，腫瘤細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，出現(xiàn)明顯的凋亡特征，并測得丹皮酚高劑量組凋亡率為21.24%。由此提示丹皮酚是通過誘導了細胞的凋亡而起到抗乳腺癌作用。

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控，許多化療藥物能夠誘導腫瘤細胞凋亡，如紫杉醇、順鉑、長春新堿等，誘導腫瘤細胞凋亡也成為腫瘤治療的一個重要的策略，目前很多藥物的開發(fā)和研制都把誘導細胞凋亡作為藥物療效的一個衡量指標。細胞凋亡的啟動是細胞在感受到相應(yīng)的信號刺激后細胞內(nèi)一系列控制開關(guān)的開啟或關(guān)閉，不同的外界因素啟動凋亡的方式也有所不同，引起的信號轉(zhuǎn)導也不相同。因為細胞類型的不同和藥物方面的差異，使藥物誘導細胞凋亡的機制非常復(fù)雜。盡管目前對細胞凋亡過程中信號傳遞系統(tǒng)的認識還不夠全面，但是，線粒體凋亡途徑和細胞表面死亡受體介導的凋亡途徑是導致程序性細胞死亡兩個主要的途徑，而線粒體凋亡途徑被公認作為藥物治療癌癥的主要途徑，在誘導腫瘤細胞凋亡過程中發(fā)揮了主要的作用。線粒體凋亡途徑主要由Bcl-2家族蛋白介導，在許多的癌細胞中，如宮頸癌、乳腺癌、胃癌等，Bcl-2家族蛋白均出現(xiàn)過表達。Bcl-2主要發(fā)揮凋亡抑制因子的作用，阻斷細胞色素C的釋放，而促凋亡成員(Bax)發(fā)揮著促進凋亡的作用。目前認為，二者的作用通常更依賴于在Bcl-2和Bax之間的平衡，而并非依賴于單獨的Bcl-2或Bax表達[7，8]。先前的研究顯示，丹皮酚能減少乳腺癌小鼠腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達而抑制腫瘤細胞的生長，本實驗進一步證明丹皮酚明顯減少腫瘤組織中Bcl-2 mRNA表達，而Bax表達卻明顯增強，進而引起B(yǎng)cl-2與Bax的mRNA比值下降。由此推測丹皮酚通過抑制或促進了Bcl-2和Bax的基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)了Bcl-2和Bax蛋白表達，進而導致線粒體釋放細胞色素C，啟動了線粒體依賴途徑。而丹皮酚作用于乳腺癌更詳細的分子機制我們將進一步的研究和探討。

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3 劉長青，譚詩云，計春燕et al.丹皮酚對大腸癌HT-29細胞的增殖抑制作用及其機制的探討[J].中國藥理學通報，2005;21(10):1251-1254.

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7 kirkin V，Joos S，Zornig M.The role of Bcl-2 family members in tumorigenesis[J].Biochimica et Biophysica Acta，2004;1644:229-249.

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