李中燕，湯 宇，田 艷，尹若熙，王國成，俞騰飛

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特 010110;2.天津天士力集團(tuán)研究院化學(xué)藥物研究所，天津300410)

磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)是催化環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水解的酶蛋白家族，其可將cAMP和cGMP水解為無活性的5'-磷酸腺苷和5'-磷酸鳥苷，進(jìn)而影響生物體的各種代謝功能。且cAMP和cGMP是體內(nèi)普遍存在的第二信使，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和中樞神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等生物學(xué)反應(yīng)中也起到重要的作用［1］。以往的報(bào)道多集中在PDE4抑制劑對cAMP的抑制功效研究，以及在嚙齒類動(dòng)物模型中對炎癥疾病的顯著治療作用等方面。據(jù)近期國外文獻(xiàn)報(bào)道，PDE4在心肌肥大、心衰和心律失常等心臟疾病中作用的研究取得較新的進(jìn)展，本文即對PDE4在這3種疾病中作用的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 PDE4及其亞型分布

PDE4是cAMP特異性的水解酶，在細(xì)胞內(nèi)其水解cAMP能力占主要地位。PDE4家族包括PDE4A，PDE4B，PDE4C及PDE4D等4個(gè)亞型，均可特異性水解cAMP。當(dāng)選擇不同的啟動(dòng)子和選擇性剪切位點(diǎn)，PDE4的各亞型都可表達(dá)多種變異體，迄今發(fā)現(xiàn)＞20種PDE4變異體，這些變異體在調(diào)節(jié)性能和亞細(xì)胞定位上都是各不相同的［2］。

PDE4廣泛分布于各種炎癥和免疫細(xì)胞中，其分布在除了血小板外的所有組織中［3］。PDE4A在單核細(xì)胞、骨骼肌、睪丸和腦橋表達(dá)較高;PDE4B則主要表達(dá)在血液和神經(jīng)組織中;PDE4C廣泛表達(dá)于身體各個(gè)部位;而PDE4D在血液和骨骼肌中表達(dá)較多［4－5］。

在心臟，PDE4存在于心房肌細(xì)胞的 Z線上，與肌節(jié)相關(guān)的α輔肌動(dòng)蛋白共存，并且其水解cAMP的活性約占PDE總水解活性的15%，其中PDE4D為表達(dá)最多的亞型［6］。然而PDE4家族的4個(gè)亞型在心臟中的分布也不盡相同，只有PDE4A，PDE4B和PDE4D在嚙齒類動(dòng)物和人的心臟組織中有表達(dá)，其中PDE4D在心房肌細(xì)胞的表達(dá)最高。目前，PDE4D基因在心肌組織中表達(dá)的亞型有PDE4D3，PDE4D5，PDE4D8和 PDE4D9。由于 PDE4C在嚙齒類及人類的表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫中無法找到，同時(shí)在大量PDE活性免疫沉淀反應(yīng)中，PDE4C均沒有明顯的表達(dá)，故沒有其進(jìn)一步的研究報(bào)道［7］。

2 PDE4與cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

在心血管系統(tǒng)中，心肌細(xì)胞對細(xì)胞外刺激信號的應(yīng)答主要是通過G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的，而其中一些重要的G蛋白偶聯(lián)受體的第二信使均為cAMP［8］。細(xì)胞內(nèi)的cAMP-蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)途徑是由G蛋白偶聯(lián)受體將信號首先傳至腺苷酸環(huán)化酶，由其控制cAMP的含量，而cAMP的含量決定PKA的活性。由于PKA負(fù)責(zé)很多蛋白的磷酸化，因此cAMP-PKA途徑以此來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生物活性反應(yīng)和平衡。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的cAMP可激活PKA，其cAMP水平的升高可增加PKA磷酸化活性，促進(jìn)L-型鈣離子通路(L-type calcium channel，LTCC)、蘭諾定受體(ryanodine receptor，RyR)、超極化激活環(huán)核苷酸門控離子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels，HCN通道)和肌原蛋白Ⅰ等的磷酸化。PDE在細(xì)胞內(nèi)的定位非?？拷黀KA，因而很有可能控制著cAMP與調(diào)節(jié)性激酶亞基作用的通路［9］。因此，PDE4能被PKA激活且能與各種錨定 PKA的骨架蛋白結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的cAMP-PKA途徑，同時(shí)也改變了PDE4對Mg2+的敏感性，使之成為調(diào)控細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的有效途徑之一［10］。

Nikolaev等［11］通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)利用活細(xì)胞成像技術(shù)檢測人心肌細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度。與異丙腎上腺素(100 nmol·L－1)作用相比較，在PDE4抑制劑Ro20-1724(10 μmol·L－1)、PDE3 抑 制 劑 西 洛 酰 胺 (cilostamide，1 μmol·L－1)及兩者聯(lián)合作用下，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度呈遞增變化，因而表明在人心房肌細(xì)胞內(nèi)PDE3和PDE4共同控制著cAMP的水平。且另有研究數(shù)據(jù)表明，在心房組織中，PDE4水解cAMP含量占總水解量的15%［12］。

3 PDE4在心臟疾病中的作用

心肌細(xì)胞的去極化可促進(jìn)Ca2+通過LTCC內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞釋放大量的Ca2+。對于心房的興奮-收縮偶聯(lián)，升高的Ca2+與肌鈣蛋白相互作用，進(jìn)而促進(jìn)橫橋相互作用及肌細(xì)胞的收縮。竇房結(jié)和心房肌上的交感神經(jīng)通過增加Ca2+內(nèi)流和循環(huán)來增加心率和心輸出。當(dāng)交感神經(jīng)活性減弱時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的PDE會(huì)降解cAMP，減弱PKA活性，由此可見心房的PDE是心率、心肌收縮和能量供給的重要調(diào)節(jié)器［13］。

在竇房結(jié)和二級起搏位點(diǎn)，少量PDE被激活可引起心動(dòng)過速，收縮活性增強(qiáng)，起搏興奮增加，這樣會(huì)促進(jìn)Ca2+超負(fù)荷，誘導(dǎo)肌細(xì)胞凋亡，是形成心衰的主要原因之一。因此，其水平的高低會(huì)在某種程度上決定心臟衰竭和卒中的危險(xiǎn)系數(shù)的高低［14］。

3.1 對心肌肥大的影響

心肌肥大是一種強(qiáng)有力的代償形式，但是這種代償形式不是無限度的，若肥大心肌的功能不能長期維持正常則會(huì)出現(xiàn)心衰現(xiàn)象。在心肌細(xì)胞中，PDE水解cAMP是眾所周知的，但是在病理?xiàng)l件下的心肌肥大模型中，PDE的作用還缺少深入的研究。

Abi-Gerges等［8］建立大鼠胸主動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)心肌肥厚的動(dòng)物模型，造模5周后觀察心臟功能并用超聲診斷儀檢測心臟各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果顯示，離體的心肌肥大的心臟，在最大劑量β腎上腺素刺激下收縮反應(yīng)減少54%，同時(shí)也伴隨著肌膜水平下cAMP減少32%，而且模型組與假手術(shù)組相比心臟重量增加了67%。分離培養(yǎng)正常對照組和心肌肥厚模型的心肌細(xì)胞，進(jìn)行PDE活性檢測實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，模型組的總PDE活性較正常對照組降低42%，同時(shí)PDE3的活性降低了42%，PDE4的活性降低了53%。對PDE4亞型的進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，模型組中PDE4A和PDE4B活性有明顯的下降。雖然PDE4D活性也有減少，但不是很顯著。

有實(shí)驗(yàn)表明，在大鼠心肌肥大模型中，PDE4水平是下降的。進(jìn)而在研究PDE4在人心臟疾病的作用中，也期待可以發(fā)現(xiàn)PDE4或PDE4亞型的活性在健康人與患者中存在的差異［16］。通過免疫沉淀法觀察發(fā)現(xiàn)，在健康人與患者中并未發(fā)現(xiàn)PDE4活性有明顯區(qū)別，但是患者數(shù)據(jù)表明，PDE4A和PDE4D的活性較正常對照組的活性有明顯的下降。在病理性心肌肥大動(dòng)物模型和人類病變的心臟上PDE4的平行性下降，說明在心臟疾病的發(fā)展進(jìn)程中，PDE4水平的改變起到顯著的作用［16］。

3.2 對心衰的影響

PDE4在控制嚙齒類動(dòng)物的心肌細(xì)胞的cAMP信號通路上起到非常關(guān)鍵的作用。PDE4失活會(huì)影響興奮-收縮偶聯(lián)中的多個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，同時(shí)會(huì)誘發(fā)小鼠心衰［17］。實(shí)驗(yàn)表明，PDE4的抑制會(huì)導(dǎo)致小鼠心肌細(xì)胞上PKA底物磷酸化程度增加，并且在人心臟心肌細(xì)胞上也有少部分蛋白被磷酸化，這說明PDE4在嚙齒類和人的心臟的cAMP信號的局部調(diào)節(jié)上起到類似的作用。

Lehnart等［18］通過大鼠胸超聲心動(dòng)圖和體內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)分析、免疫沉淀反應(yīng)和免疫印跡分析、PDE活性檢測及β-腎上腺素受體測定等多種分析方法研究，其結(jié)果表明，大鼠體內(nèi)PDE4D基因失活會(huì)導(dǎo)致一系列心肌癥，誘發(fā)心力衰竭和心律失常，促進(jìn)心肌梗死。

活化型G蛋白向抑制型G蛋白偶聯(lián)的轉(zhuǎn)變急劇加速心衰的發(fā)生，而β抑制蛋白和PDE4D5轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜可以降解β腎上腺素刺激下升高的 cAMP，防止 PKA磷酸化β腎上腺素受體，使偶聯(lián)的G蛋白由活化型向抑制型轉(zhuǎn)變，這可能是機(jī)體對抗心衰的一種保護(hù)機(jī)制［19］。心房的興奮-收縮偶聯(lián)和房室節(jié)律點(diǎn)的活性都依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+循環(huán)，而Ca2+循環(huán)的改變會(huì)對心衰的發(fā)生有很大影響。在人類和動(dòng)物的心力衰竭樣本中發(fā)現(xiàn)，PDE4的缺乏會(huì)導(dǎo)致RyR2通道的過度磷酸化，從而使RyR2通道“漏鈣”，誘發(fā)心衰［20］。

PDE4D3存在于心臟RyR2/Ca2+復(fù)合體中，PDE4D3在細(xì)胞內(nèi)與RyR2和PKA形成大分子復(fù)合物，調(diào)控由PKA介導(dǎo)的RyR2磷酸化而控制Ca2+從肌漿網(wǎng)中釋放。事實(shí)上PDE4D3提供了一個(gè)非常重要的負(fù)反饋機(jī)制來限制β腎上腺素受體依賴的PKA磷酸化RyR2-Ser2808位點(diǎn)。生理?xiàng)l件下，PDE4D3可通過RyR2-Ser2808位點(diǎn)磷酸化調(diào)節(jié)PKA活性和通道的激活，進(jìn)而防止cAMP的過度積累。在心衰患者的心肌細(xì)胞上，由于在RyR2上PKA過度磷酸化、穩(wěn)鈣蛋白消耗等，導(dǎo)致RyR2上缺乏PDE4D3這種負(fù)反饋機(jī)制，因而心臟中的PDE4D3起到阻礙心衰和心律失常的重要作用［18］。

在對心衰的人類心肌RyR2復(fù)合體的含量測定中發(fā)現(xiàn)，PDE4D3較正常組含量減少了43%，PDE4D3水解cAMP的活性降低了42%，這樣就導(dǎo)致PKA過度磷酸化及RyR2信號通路泄露，進(jìn)而誘發(fā)心功能障礙和心律失常的發(fā)生［21］。

3.3 對心律失常的影響

心房顫動(dòng)是由于隨機(jī)的放電引起的一種迅速而不規(guī)律的心跳，是一種最常見的持續(xù)性心律失常。該病癥使血液在心臟中聚集并凝塊，會(huì)明顯增加卒中的風(fēng)險(xiǎn)。高齡是心房顫動(dòng)并發(fā)中風(fēng)的潛在危險(xiǎn)因素之一，心房顫動(dòng)患者中風(fēng)的概率隨著年齡的增長呈指數(shù)增長。心房顫動(dòng)的發(fā)病率和患病率隨著年齡而增長，大約有50%的心房顫動(dòng)患者年紀(jì)大于75歲［22］。

LTCC功能和蛋白表達(dá)的減少是心房顫動(dòng)的主要分子特征，心房顫動(dòng)同時(shí)伴隨膜受體的重構(gòu)和cAMP依賴的Ca2+水平的改變，在這種情況下，水解cAMP的PDE對心房顫動(dòng)的發(fā)生會(huì)起到非常重要的影響［23］。

Molina等［24］通過熒光共振能量轉(zhuǎn)換傳感器，檢測在β腎上腺素刺激下的離體人心肌細(xì)胞中的L型Ca2+電流和鈣波，同時(shí)運(yùn)用活細(xì)胞成像技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平，觀察其熒光率的衰減對cAMP的水解速率的影響。當(dāng)PDE4受抑制后，細(xì)胞內(nèi)的cAMP的水解速率明顯減慢。在β腎上腺素刺激下，細(xì)胞內(nèi)的cAMP的水解速率延伸，從而導(dǎo)致L型Ca2+電流反應(yīng)延長了2倍，而這種延長主要是由于LTCC的PKA磷酸化延長產(chǎn)生的。結(jié)果表明，PDE4抑制會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)cAMP和L型Ca2+電流，并且很大程度上推遲其在β腎上腺素受體刺激后的衰變。同樣，PDE4受抑制也會(huì)增加β腎上腺素刺激下人心房的鈣波頻率、收縮反應(yīng)以及心律失常的發(fā)生率。

在人正常的心房肌小梁上，抑制PDE4活性可增加β腎上腺素受體的收縮反應(yīng)及心律失常的收縮活動(dòng)。對竇性心律患者和永久性心房心律失?；颊叩男姆拷M織中的PDE4活性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，與竇性心律患者相比，永久性心房顫動(dòng)患者的PDE4的活性有明顯的下降［25］。因而在人心房肌中，PDE4對控制cAMP水平進(jìn)而控制Ca2+內(nèi)流和釋放起到至關(guān)重要的作用，并限制了心率失常的易感性。

4 展望

目前，對心房顫動(dòng)誘發(fā)卒中的治療主要集中的抗凝血?jiǎng)┑膽?yīng)用。但是，以選擇性地提高PDE4D活性為靶點(diǎn)研究新的給藥劑型，可同時(shí)預(yù)防心房收縮功能障礙、限制與Ca2+循環(huán)有關(guān)的心房能量供給、有效預(yù)防心房顫動(dòng)并降低卒中風(fēng)險(xiǎn)。

在血管、炎癥細(xì)胞和血小板中，cAMP水平上升會(huì)導(dǎo)致血管舒張，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長、增殖、遷移、新生內(nèi)膜形成及血小板聚集等，若這些細(xì)胞類型中PDE4D的表達(dá)減少，則會(huì)很大程度上增加心源性卒中的危險(xiǎn)性［26］。雖然國內(nèi)外對PDE4D基因與卒中相關(guān)的確切機(jī)制研究不太全面，但是學(xué)者普遍認(rèn)同其不僅參與動(dòng)脈粥樣硬化，而且具有神經(jīng)保護(hù)作用。因而今后對PDE4D基因尚需更深入的研究，以期其對卒中的預(yù)防和治療起到關(guān)鍵的作用［27］。

由于PDE4抑制劑誘導(dǎo)RyR2通路缺失，長期使用抑制劑的患者易患心律失常和心衰的幾率大幅增加。這使得PDE4抑制劑在治療支氣管哮喘和慢性阻塞性肺病等疾病中產(chǎn)生的副作用變得尤為突出，同時(shí)也為PDE4和PDE4抑制劑的合理應(yīng)用提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。隨著PDE4及其抑制劑對心臟疾病的作用機(jī)制研究日趨深入及其在藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)和藥理作用機(jī)制的研究不斷深入，PDE4的抑制劑將有望成為治療心臟病的特異性藥物。

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