李婷婷，劉海燕，謝建忠，蔣學(xué)華，王 凌

(1.西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院藥劑科，云南景洪 666100;2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院臨床藥學(xué)與藥事管理學(xué)系，四川成都 610041)

胎盤由胎兒的絨毛膜與母體的底蛻膜共同構(gòu)成，是妊娠期間胎兒與母體聯(lián)系的重要器官，擔(dān)負著物質(zhì)交換、代謝、分泌和屏障等生理功能。位于母體血液循環(huán)和胚胎循環(huán)之間的滋養(yǎng)層細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞以及二者間的基膜能阻止一些外來化合物由母體進入胚胎，起到一定的生理屏障的功能，稱胎盤屏障。既往一般認為胎盤屏障功能僅依賴于生物膜的半透性，近年的研究揭示，胎盤上同時存在細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)超家族、P－糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)、乳腺癌(干細胞)耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、有機陰離子轉(zhuǎn)運肽(organic anion transporting polypeptides，OATP)、有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(organic cation transporter，OCT)和單羧基酸轉(zhuǎn)運蛋白(monocarboxylate transporter，MCT)等多種代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白［1］，共同決定母體化合物是否能通過胎盤進入胎兒循環(huán)，因此，僅依賴藥物基本生化特征難以準(zhǔn)確預(yù)測其胎盤透過率。然而，了解藥物的胎盤屏障透過能力對妊娠期用藥至關(guān)重要，使用易透過胎盤屏障的藥物可能影響胎兒的生長發(fā)育，甚至造成畸形和死胎;另一方面，若母體嚴(yán)重疾病得不到及時有效的治療同樣影響胎兒的發(fā)育，因此，預(yù)測藥物的胎盤透過性能意義深遠。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，胎兒宮內(nèi)治療已成為降低圍產(chǎn)兒死亡率以及提高了新生兒生存質(zhì)量的一種重要手段。在宮內(nèi)治療的眾多方法中，通過母體給藥進行藥物治療具有安全、無創(chuàng)和簡便等優(yōu)點，廣泛適用于宮內(nèi)胎兒各種感染性疾病、內(nèi)分泌疾病和心律失常等疾病的治療［2－3］。然而，胎盤屏障是很多藥物進入胎兒血液循環(huán)發(fā)揮治療作用的一大障礙，不同藥物透過胎盤的性能不同，在選用藥物時考慮其透過胎盤的能力是治療成功與否的關(guān)鍵?；谔ケP上分布的眾多轉(zhuǎn)運體和代謝酶是藥物胎盤屏障的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［4］，使用藥學(xué)或其他方法干預(yù)其功能或表達可能是經(jīng)母體給藥進行胎兒宮內(nèi)治療的一個新策略。

受醫(yī)學(xué)倫理和研究方法的限制，目前我國藥物胎盤轉(zhuǎn)運機制及其干預(yù)策略方面的研究尚處于初始階段。然而，研究胎盤藥物轉(zhuǎn)運意義重大，不僅可以指導(dǎo)妊娠期合理用藥，還能為優(yōu)化胎兒宮內(nèi)藥物治療提供科學(xué)的依據(jù)，有必要對其進行更深入的了解。本文綜述了胎盤的發(fā)育過程及胎盤小葉灌流、傳代細胞系、原代細胞、外植體及絨毛組織塊等目前體外研究人胎盤的主要模型及其特點做一概述，以便于有針對性地選擇合適的模型進行胎盤研究。

1 胎盤的發(fā)育過程及其代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白的表達

胎盤為胚胎和母體子宮之間的一個圓形或橢圓形盤狀器官，有兩個面，胎兒面光滑，由一條臍帶與胚胎相連，母體面粗糙，與子宮內(nèi)壁緊密接觸，其主體部分為樹枝狀的絨毛組織，絨毛的表層是滋養(yǎng)層上皮，中層為結(jié)締組織和血管。胎盤有兩套血液循環(huán)，絨毛中血管屬胎兒系統(tǒng)，絨毛間隙與蛻膜區(qū)的屬母體系統(tǒng)。該結(jié)構(gòu)使胎盤能完成其最基本的功能—物質(zhì)交換:將胚胎發(fā)育所需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)源源不斷地從母體供給胎兒，同時將胚胎產(chǎn)生的代謝物運送回母體排出。成熟的胎盤由17～21個胎盤小葉組成，含有滋養(yǎng)層細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、霍夫鮑爾細胞及血細胞等多種細胞成分，表達多種代謝酶及轉(zhuǎn)運蛋白。

胎盤和胎兒都是從同一個細胞——受精卵演變而來，胎盤是胚外結(jié)構(gòu)，胚泡外壁的滋養(yǎng)層細胞是胎盤的早期結(jié)構(gòu)，著床后分化成合體滋養(yǎng)層細胞。胚胎發(fā)育至18～20 d時，作為胎盤主要結(jié)構(gòu)的絨毛組織逐漸形成，約在受精后第3周，絨毛內(nèi)血管逐漸形成開始建立胎兒循環(huán)。第6孕周開始，使用三維陰道超聲及多普勒血管造影可見母體絨毛間逐漸增強的血流［5］。妊娠3個月左右，胎盤的基本輪廓逐漸形成，但僅有6～10個胎盤小葉，絨毛內(nèi)血管分支較稀疏，管徑也較細。之后數(shù)月，其形態(tài)和功能逐漸完善，最終發(fā)育成成熟胎盤。

研究發(fā)現(xiàn)，早在合體滋養(yǎng)細胞階段，面對母體的刷狀緣以及面對胎兒的基底膜上即開始表達多種轉(zhuǎn)運蛋白［6］。按其功能可分為攝取轉(zhuǎn)運蛋白和外排轉(zhuǎn)運蛋白，攝取轉(zhuǎn)運蛋白增加某些大分子物質(zhì)或營養(yǎng)成分的胎盤透過率，而外排轉(zhuǎn)運蛋白能阻止許多外源性異物進入胎兒循環(huán)。胎盤表達的主要攝取轉(zhuǎn)運體包括 OATP4A1，OATP2B1，OCTN2及OCTN1，這些攝取蛋白主要負責(zé)從母體血中攝取大分子營養(yǎng)物質(zhì)，許多藥物也通過它們進入胎盤，如口服降糖藥二甲雙胍即通過OCT3進入胎盤;而P－gp，BCRP和多藥耐藥相關(guān) 蛋 白 2(multidrug resistance－associated protein 2，MRP2)等外排蛋白可將進入胎兒側(cè)的藥物重新排入母體側(cè)，是導(dǎo)致眾多藥物胎盤透過率低的主要原因。其中隸屬ATP結(jié)合盒(ATP－binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運體家族的P－gp是胎盤表達的一種典型的外排轉(zhuǎn)運蛋白，能阻止許多有害物質(zhì)及藥物透過胎盤，對胚胎的發(fā)育起到一定的保護作用［7］。動物實驗證實，抑制胎盤上的P－gp顯著增加伊維菌素(ivermectin)的致畸性［8］。然而，隨著合體滋養(yǎng)層細胞逐漸發(fā)育成成熟胎盤，其P－gp的表達量逐漸降低，研究發(fā)現(xiàn)，妊娠早期(60～90 d)胎盤表達的P－gp比足月胎盤高約44.8倍［9］。胎盤上表達的各種代謝酶在一定程度上也阻止外源性異物透過胎盤進入胎兒循環(huán)。胎盤發(fā)育的不同階段表達的代謝酶不同，第一孕期可能僅少數(shù) CYP代謝酶在mRNA水平有表達［10］。根據(jù)目前的研究，胎盤上有功能表達的CYP酶亞型包括CYP1A1，CYP4B1，CYP19以及新近發(fā)現(xiàn)的CYP2S1［11－13］。然而，這些代謝酶的表達受眾多因素的調(diào)節(jié)，如近期的研究發(fā)現(xiàn)，母親肥胖可導(dǎo)致胎盤上CYP1A1 的表達明顯降低［14］。此外，Demendi等［15］發(fā)現(xiàn)，11β－羥基類固醇脫氫酶 2(11β－h(huán)ydroxysteroid dehydrogenase type 2，11βHSD2)也是胎盤屏障的一個重要組成成分，其主要功能是在母體血糖升高時保護胎兒免受高糖損傷。

2 藥物胎盤轉(zhuǎn)運的體外研究方法及應(yīng)用

2.1 胎盤小葉灌流

2.1.1 胎盤小葉灌流方法

體外人體胎盤灌流是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一項技術(shù)，其原理為采用剛分娩出的人體胎盤，模擬體內(nèi)條件確保胎盤的生物活性，建立體外母體循環(huán)和胎兒循環(huán)，在母體側(cè)灌流液中加入一定濃度的待測藥物或化學(xué)物，平衡一段時間后，通過檢測胎兒側(cè)灌流液中待測物濃度確定其胎盤透過性。但由于整體胎盤灌流成功率極低，70年代被簡化為胎盤小葉灌流，是目前唯一在器官水平研究胎盤屏障功能的模型，近期的一項分析顯示該模型與體內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運具有很好的相關(guān)性，能用于預(yù)測體內(nèi)胎盤藥物轉(zhuǎn)運情況，使用蛋白結(jié)合和血液pH調(diào)節(jié)該模型檢測結(jié)果可使其對體內(nèi)情況的預(yù)測更精確［16］。

2.1.2 胎盤小葉灌流模型特點

雖然該模型能很好地模擬體內(nèi)藥物胎盤透過情況，但由于其操作難度較高，成功率低，且胎盤小葉體外存活時間有限，難以用于大規(guī)模的藥物篩選。試驗期間需確保胎盤具有生物活性也增加了該模型的應(yīng)用難度，常用的活性監(jiān)測方法包括葡萄糖消耗量、氧消耗、pH值、乳酸生成量和胎盤激素的分泌以及組織形態(tài)變化等。該模型的具體細節(jié)如胎兒和母體循環(huán)的建立方法、灌流速度、灌流液總量、含氧混合氣體組成等各實驗室均不完全一致。

模型建立是否成功的評價亦無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，一般認為胎兒循環(huán)灌流液損失量越小越好，可以接受的滲漏丟失量范圍為2～3 ml［17］;評價離體小葉灌流模型的另一方法為選用一種或幾種對胎盤具有穩(wěn)定透過性的藥物從母體側(cè)灌流，通過計算該物質(zhì)的胎盤透過率評價該模型是否成功，最常用的標(biāo)記物為解熱鎮(zhèn)痛藥安替比林，也有試驗選用葡萄糖、菊糖、肌酐等。

2.1.3 胎盤小葉灌流模型應(yīng)用

胎盤小葉灌流模型已被廣泛用于足月及不足月胎的藥物透過情況評估。有研究使用該模型比較了足月胎盤(38～41周)和不足月胎盤(27～34周)對P－gp底物美沙酮的通透性，結(jié)果顯示足月胎盤對美沙酮的通透性較不足月胎盤高30%［18］。這與先前的研究結(jié)果P－gp在胎盤的發(fā)育過程中表達量逐漸降低相一致。

近期的一項研究使用該模型評估了抗病毒藥物磷酸奧司他韋的體內(nèi)活性代謝物——奧司他韋羧酸鹽的胎盤透過性能，用 H－3 同位素標(biāo)記的奧司他韋羧酸鹽350 μg·L－1和14C同位素標(biāo)記的安替比林20 mg·L－1的灌流液從母體側(cè)灌入，高效液相色譜法檢測母體側(cè)、胎盤組織及胎兒側(cè)灌流液中原型藥物及其所有代謝產(chǎn)物，灌流4 h后，約21%的藥物進入胎兒循環(huán);13%的藥物滯留于胎盤小葉;66%留在母體側(cè)灌流液中，其胎盤透過率為安替比林的47%，證實奧司他韋羧酸鹽存在胚胎暴露［19］。同樣，Nanovskaya 等［20］用類似的方法證實萬古霉素及特拉萬星(telavancin)存在低胎盤透過率。

此外，胎盤小葉體外灌流還可用于研究個體間藥物透過差異的原因，Tertti等［21］近期的研究顯示，可溶性物質(zhì)載體(solut carrier，SLC)家族的SLCO1B3的基因多態(tài)性可能影響口服降糖藥瑞格列奈的胎盤轉(zhuǎn)運，遺憾的是，由于該實驗樣本量較小，未達統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 人胎盤傳代細胞系

2.2.1 人胎盤常用傳代細胞系及其特點

毒理學(xué)研究常用的人胎盤細胞株有3種:BeWo，JAR和JEG－3，均來源于絨毛膜癌細胞，均表達于人體胎盤相似的異物代謝酶，如CYP1A1，CYP19等［22］，均可用于研究胎盤激素分泌、胎盤細胞對外源性異物的攝取、外排以及代謝。BeWo，JAR和JEG－3也可用于研究胎盤的藥物轉(zhuǎn)運，但值得注意的是，鑒于傳代細胞系的來源及永生化處理，其轉(zhuǎn)運蛋白表達與原代滋養(yǎng)細胞不完全一致:BeWo，JAR和JEG－3細胞株的P－gp表達均比從足月胎盤分離的原代滋養(yǎng)細胞低得多，有的甚至低于檢測限［23］;而對于 BCRP，BeWo 和JAR的表達與人體胎盤相似，JEG－3較低;BeWo和JAR細胞的ABCC2較原代滋養(yǎng)細胞高而ABCC1較原代滋養(yǎng)細胞低。BeWo細胞保留了許多人滋養(yǎng)細胞的形態(tài)學(xué)特征［24］，其形態(tài)類似含有少量合胞體細胞的未分化滋養(yǎng)細胞。與BeWo細胞株不同，JEG－3細胞更多地保存了合體滋養(yǎng)層細胞的生理和生化特征［25］。

2.2.2 傳代細胞的研究應(yīng)用

細胞水平研究胎盤屏障功能的常用細胞株為BeWo b30，它能在Transwell培養(yǎng)板上長成緊密極化的單層細胞。一般認為此模型與體內(nèi)胎盤屏障真實情況有一定的差距，有趣的是，對多種底物藥物的研究發(fā)現(xiàn)該模型與胎盤小葉灌注模型結(jié)論高度一致，后又有研究者使用該模型研究了安替比林、草甘膦、苯甲酸、咖啡因等4種藥物的胎盤透過性，經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)其與體內(nèi)情況也能很好地吻合［26］。

值得注意的是，以上涉及的藥物均不是外排性轉(zhuǎn)運蛋白P－gp底物，鑒于細胞系胎盤屏障模型上P－gp表達顯著低于生理情況，用其預(yù)測P－gp底物的體內(nèi)胎盤透過率可能欠妥。盡管在所有BeWo細胞克隆中，b30克隆株的P－gp表達最高，其與生理情況下胎盤的P－gp表達量仍存在較大差距。因此，有研究者嘗試用載有ABCB1基因的病毒載體轉(zhuǎn)染BeWo細胞，定量PCR檢測顯示轉(zhuǎn)染細胞P－gp的表達量可達常用BeWo細胞的10倍左右，有研究者進一步使用該轉(zhuǎn)染模型驗證了P－gp介入了糖皮質(zhì)激素的胎盤屏障［27］。理論上使用過表達P－gp且能形成單層緊密連接的傳代細胞系能較好地模擬胎盤屏障用于研究P－gp底物藥物的胎盤轉(zhuǎn)運，但目前相關(guān)報道仍較少，有待更多的研究對該模型加以驗證。

另外，一些研究考察了該模型對非藥物的有害物質(zhì)的屏障作用:Nielsen等［28］使用該模型檢驗了一種致癌性物質(zhì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的胎盤透過能力，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)的胎盤轉(zhuǎn)運存在延遲現(xiàn)象，而這一結(jié)論也被體外胎盤灌流模型證實;最近的一項通過該模型和胎盤小葉灌流模型考察赭曲霉毒素A胎盤透過能力的研究也證實，兩模型得出的結(jié)論一致——僅少量(約3%)的赭曲霉毒素A能透過胎盤［29］。

近期的研究還發(fā)現(xiàn)，JEG－3和BeWo b24也有長成單層極化緊密連接的潛力，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臈l件優(yōu)化有望成為體外研究胎盤藥物轉(zhuǎn)運的模型［30－31］。

2.3 原代細胞

原代的人胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞也可被分離、消化、純化，但過程較復(fù)雜［32］，一般一次分離較多的細胞，凍藏后分次取用。顯然，相對于癌細胞株，原代細胞能更真實地展現(xiàn)正常胎盤組織的生理生化特點。遺憾的是，原代胎盤細胞不能增殖，無法形成緊密連接的單層細胞，也就不能用于體外模擬胎盤屏障。另外，原代細胞在體外培養(yǎng)一段時間后，其轉(zhuǎn)運蛋白的表達可能會發(fā)生變化。Evseenko等［23］報道，體外培養(yǎng)120 h后，從足月胎盤分離的滋養(yǎng)細胞中P－gp明顯降低，而BCRP卻升高。這些特點限制了原代細胞在藥物胎盤轉(zhuǎn)運研究中的應(yīng)用。

2.4 胎盤外植體及絨毛組織

人體胎盤外植體及絨毛組織培養(yǎng)廣泛用于研究胎盤的轉(zhuǎn)運體、代謝酶表達以及內(nèi)分泌功能。因絨毛組織塊內(nèi)尚含有大量的間充質(zhì)干細胞(成纖維細胞、肌成纖維細胞和平滑肌細胞等)，近期也用于研究胎盤的增殖、分化［32］，還用于研究增殖和分化相關(guān)信號通路及其影響因素［33］。同樣，外植體及絨毛組織因不是完整的半透膜不能用于評價藥物的胎盤透過性。且與原代細胞不同的是，用于培養(yǎng)的胎盤組織必須是新鮮的，不能凍融，這更加增加了其實際應(yīng)用的難度。

分離疾病狀況下胎盤組織檢測某些成分如轉(zhuǎn)運蛋白的表達或功能變化既可用于其病理生理學(xué)研究，在一定程度上也可以為該疾病的診斷提供新思路。例如，最近的一項研究發(fā)現(xiàn)羊水過少的足月胎盤上水通道蛋白8和水通道蛋白9的表達明顯低于羊水正常的胎盤，這兩種蛋白在羊水的形成和轉(zhuǎn)運中均起到非常重要的作用，可能能通過上調(diào)其表達來治療羊水過少［34］。

2.5 細胞亞結(jié)構(gòu)研究

使用不同的離心方法可分離滋養(yǎng)細胞的亞成分，如微粒體和細胞質(zhì)等用于研究代謝酶對外源性異物的代謝能力［35］。刷狀緣和基膜上的另一亞結(jié)構(gòu)—膜囊泡因天然表達某些轉(zhuǎn)運蛋白也被分離用于研究基本轉(zhuǎn)運機制，也可在分離的膜囊泡上過表達某些轉(zhuǎn)運體來研究其對底物的轉(zhuǎn)運特點［36］。近期的一項研究即利用足月胎盤微絨毛漿膜中分離出來的囊泡研究甲狀腺素激素的母體－胎兒轉(zhuǎn)運，發(fā)現(xiàn)母體的T(3)和T(4)主要通過MCT8和MCT10轉(zhuǎn)運進入胎兒循環(huán)［1］。

3 展望

人體胎盤因分娩后易獲得而廣泛用于體外研究，目前已建立多種體外研究胎盤功能的方法及試驗?zāi)Ｐ?。在眾多的方法中，只有胎盤小葉灌流模型及能長成單層緊密連接的細胞模型可用于研究藥物或其他化合物胎盤屏障透過能力，而原代滋養(yǎng)體細胞分離培養(yǎng)、胎盤組織塊分離、細胞亞結(jié)構(gòu)分離以及其他的癌源性細胞株只可用于轉(zhuǎn)運體及代謝酶的功能或表達、胎盤的增殖分化及內(nèi)分泌功能等研究。最近的研究表明，體外胎盤小葉灌流模型能很好地預(yù)測體內(nèi)藥物胎盤藥物透過率，但其建模困難和存活時間短(2～6 h)不適于大規(guī)模檢測藥物的胎盤屏障透過率。用永生細胞株建立的胎盤屏障細胞模型可用于大量藥物的透過性檢測，且近期的研究也證實，對于多種藥物的轉(zhuǎn)運，該模型與小葉灌流模型或體內(nèi)藥物透過情況存在較好的一致性，然而，檢測所用的藥物種類有限，且尚未涉及 P－gp等轉(zhuǎn)運體的底物藥物，而BeWo 30b和JEG－3等細胞株上轉(zhuǎn)運體的表達與原代滋養(yǎng)體細胞存在較大差異，該模型能在多大范圍內(nèi)預(yù)測體內(nèi)藥物胎盤透過情況有待進一步探討。

總的來說，目前已有多種體外研究胎盤功能的試驗?zāi)Ｐ?，但尚無一種方法能有效地對藥物的胎盤透過能力進行常規(guī)篩查，有待建立更完善的體外方法來預(yù)測藥物體內(nèi)胎盤屏障透過情況。對現(xiàn)有模型進行優(yōu)化，使其在符合研究要求的同時更接近生理狀況可能為一個可行的策略，如轉(zhuǎn)染傳代細胞系使其過表達外排轉(zhuǎn)運體用于評價其底物藥物的胎盤透過情況。研究藥物的胎盤轉(zhuǎn)運機制對解析藥物有效性、安全性和毒性具有重要意義，盡管目前該領(lǐng)域的研究尚欠缺系統(tǒng)性，研究模型也存在各自的局限性，隨著分子生物學(xué)、基因工程等現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)的不斷發(fā)展，研究模型的創(chuàng)新和優(yōu)化將為該領(lǐng)域的發(fā)展帶來廣闊的前景。

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