蔣 艷，張 彥，陳翠京

(軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院超聲科，北京 100071)

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPC)是能分化為成熟內(nèi)皮細胞的細胞，不僅參與胚胎時期的血管新生，還參與出生后的血管生成、血管再生和內(nèi)皮修復。EPC來源廣泛，近年來，相繼發(fā)現(xiàn)其存在于人的臍血、骨髓、外周血、骨骼肌、脂肪和心臟等組織中，同時EPC在腫瘤臨床診斷和治療中的應用研究取得一定進展。

1 內(nèi)皮祖細胞的來源、結(jié)構(gòu)和功能特點

早期的EPC出現(xiàn)于胚胎第15天左右，參與胚胎時期的血管新生。出生后的EPC主要存在于骨髓中，機體需要時在多種細胞因子作用下遷移至外周血，循環(huán)歸巢至缺血組織參與血管新生［1］。研究表明，骨髓中亦存在 2 種 EPC［2］。一種是早期EPC，來自于外周血單個核細胞，呈集落樣生長，培養(yǎng)3～5 d后呈現(xiàn)紡錘形，第2～3周時達生長高峰，第4周時逐漸死亡消失;另一種是晚期EPC，來自于骨髓的單個核細胞，少量存在于外周血，呈鋪路石樣生長，培養(yǎng)第2周～第4周時，其細胞集落出現(xiàn)在早期EPC中間，呈鵝卵石形，第4～第8周呈指數(shù)生長，第12周逐漸死亡消失。兩種EPC均能攝取結(jié)合FITC標記的荊豆凝集素Ⅰ(FITC-Ulex europaeus agglutinin-Ⅰ，F(xiàn)ITC-UEA-Ⅰ)和 DiⅠ標記的乙?；?低 密 度 脂 蛋 白 (DiⅠ-acetyl low density lipoprotein，DiⅠ-acLDL)且雙陽性細胞無明顯差異。晚期EPC中血管內(nèi)皮生長因子 2(vascular endothelial growth factor-2，VEGF-2)的表達更高，而早期EPC CD133表達更高。說明晚期EPC具有更強的增殖和形成新生血管的能力，早期EPC則具有更強的遷移能力［3］。雖然EPC既有內(nèi)皮細胞特性，又有祖細胞特性，也表達相應的表面分子，但是目前尚無特異性的細胞表面標志物。目前比較公認的是把同時具有 CD34，AC133和 VEGFR-2表面標志，并可吸收DiⅠ-acLDL、結(jié)合FITC-UEA-Ⅰ的EPC認為是正在分化的EPC［4］。目前，關(guān)于EPC表面標志物的研究也在不斷完善和更新。最近Mund等［5］研究認為，真正意義上的EPC是在CD146+CD45－細胞群內(nèi)。

2 腫瘤與血管新生

腫瘤是克隆性異常增生的病變，其行為特點決定了其需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供應。而充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應就需要大量的血管和血液提供。一般認為，腫瘤的生長可分為無血管期和血管期。無血管期腫瘤主要依靠周圍組織的彌散來獲取營養(yǎng)物質(zhì)，排泄代謝產(chǎn)物，腫瘤生長較緩慢，腫瘤組織極少超過2～3 mm。血管期腫瘤內(nèi)出現(xiàn)新生毛細血管并獲得進一步生長的能力，腫瘤迅速生長并可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。大多數(shù)腫瘤組織起初以無血管的方式生長，直到其增殖和凋亡速率達到平衡，基本維持在封閉的休眠狀態(tài)。而腫瘤一旦從休眠期蘇醒，進入血管期，對營養(yǎng)物的依賴性則更強，直至達到一定大小。因此，腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移均具有高度的血管依賴性［6］。

3 內(nèi)皮祖細胞與腫瘤

腫瘤血管的新生既包括腫瘤誘發(fā)的血管生成，即在原有血管基礎(chǔ)上向腫瘤組織方向以出芽方式形成血管的過程，也包括了血管發(fā)生，它是由EPC歸巢至血管新生位點參與血管新生。Rehman等［7］報道，體外培養(yǎng)的EPC能夠分泌多種促血管生長因子，如VEGF、粒細胞集落刺激因子和粒巨細胞集落刺激因子等，通過自分泌和旁分泌效應可以促進血管生成過程，有利于新生血管的形成。腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境中的細胞釋放的細胞因子和化學因子可以誘導單核細胞進入腫瘤組織，而且EPC一旦進入腫瘤組織將被誘導表達促血管形成因子和腫瘤促進因子，包括VEGF、血小板衍生因子、成纖維細胞生長因子、腫瘤壞死因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，尤其是VEGF，即腫瘤的生長和EPC的發(fā)育分化具有相互促進的作用。大量的研究證明，EPC參與腫瘤血管新生，大多數(shù)腫瘤患者外周血中EPC的增多與腫瘤的分期及大小呈正相關(guān)［8－10］，并且與患者的生存率呈負相關(guān)［11］。

4 內(nèi)皮祖細胞在腫瘤研究中的應用

基于EPC作為內(nèi)皮細胞的前體細胞，并且具有高度的增殖潛力，其在血管相關(guān)性疾病中的應用價值甚大。腫瘤的血管依賴性決定任何可以干擾血管形成的物質(zhì)皆可對腫瘤的生長造成影響，從而抑制腫瘤生長。目前EPC在腫瘤研究中的應用主要集中于兩個方面，一是通過半定量測定腫瘤患者體內(nèi)EPC含量，以其作為生物標志物用來衡量、判定腫瘤良惡性、腫瘤的分期及療效評估等;二是直接應用于腫瘤治療，通過EPC干擾阻滯血管生成達到抑制腫瘤生長的目的。

4.1 內(nèi)皮祖細胞作為腫瘤的生物標志物

腫瘤的標志物是可以反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)，可以由腫瘤組織自身產(chǎn)生，也可由腫瘤與宿主相互作用后產(chǎn)生，如與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的多態(tài)性的單核苷酸和微RNA等，它們在正常組織中檢測不到或在腫瘤組織中的含量遠遠超過正常組織。目前臨床上常用的腫瘤標志物主要有兩類，一類是癌胚蛋白，如原發(fā)性肝癌最靈敏最特異的標志甲胎蛋白和提示消化道腫瘤的癌胚抗原等;另一類是腫瘤抗原，包括糖類抗原19-9(CA19-9)(較正常值升高主要提示胰腺癌)、糖類抗原125(CA125)(明顯升高主要提示卵巢癌與子宮內(nèi)膜癌)和前列腺特異性抗原等。而腎細胞癌和非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma，NHL)等腫瘤患者的外周血中并未發(fā)現(xiàn)類似上述特異性和敏感性的標志物，乳腺癌化療療效的評估亦缺乏相應的外周血指標。目前EPC的研究有望補充該指標。

Yang等［12］分析55例腎細胞癌患者、33例腎良性腫瘤患者和40例健康志愿者外周血循環(huán)EPC水平，并研究其與血清內(nèi)皮生長因子的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)腎細胞癌患者外周血中EPC水平(0.28%)明顯高于腎良性腫瘤患者(0.017%)和健康志愿者(0.076%)，并且Ⅲ期和Ⅳ期腎細胞癌患者較之Ⅰ期和Ⅱ期患者更高(0.339%vs 0.243%，P ＜0.01)。病灶＞7 cm腎細胞癌患者EPC平均為0.331%，明顯高于病灶≤4 cm的患者(0.225%)和病灶4～7 cm的患者(0.231%)(P＜0.01)，并且 EPC 水平與患者血清 VEGF水平呈正相關(guān)。該研究提示，EPC有可能作為一種新型腎細胞癌的生物標志物。

Yu等［13］用流式細胞儀分析41例NHL患者和16名健康受試者外周血中 CD133+，CD34+和 VEGFR-2(CD309)+細胞百分率，發(fā)現(xiàn)NHL患者循環(huán)EPC百分率明顯高于對照組，而且Ⅲ～Ⅳ期NHL患者循環(huán)EPC百分率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期NHL患者。NHL患者EPC百分率與性別和病理類型無相關(guān)性。為此，他們建議將NHL患者循環(huán)EPC的過度增加作為一種新的生物標志物可用于NHL患者的診斷和分期。

Kuo等［14］檢測乳腺癌化療患者循環(huán)內(nèi)皮細胞、有活性的循環(huán)內(nèi)皮細胞和循環(huán)EPC發(fā)現(xiàn)，從第一個化療周期的第1天起三者均顯著減少?；?周后，循環(huán)內(nèi)皮細胞和有活性的循環(huán)內(nèi)皮細胞均恢復到第1天的水平，循環(huán)EPC仍然較低，但是逐步回升，直到下一個化療周期。經(jīng)過6個周期的化療，循環(huán)內(nèi)皮細胞和有活力的循環(huán)內(nèi)皮細胞總數(shù)走向減少的趨勢，而循環(huán)EPC朝著增加的趨勢發(fā)展，其中一些臨床因素如腫瘤的類型、化療方案和粒細胞集落刺激因子的使用等并未對此產(chǎn)生顯著影響。在將來通過抑制血管生成并結(jié)合化療治療腫瘤的研究中，循環(huán)內(nèi)皮細胞和循環(huán)EPC數(shù)量在每個化療期間和化療后的變化，對于將循環(huán)內(nèi)皮細胞和EPC作為血管發(fā)生的替代標記物提供實驗依據(jù)。

4.2 內(nèi)皮祖細胞作為抗腫瘤藥物用于腫瘤治療

腫瘤的治療手段主要是手術(shù)切除、放療和化療。目前免疫治療成為第4種腫瘤治療模式，常作為一種輔助療法與手術(shù)、放療和化療等常規(guī)治療聯(lián)合應用。但是針對不同的病理類型、不同的腫瘤分期和不同的治療方案，常規(guī)的治療在部分腫瘤患者中仍不能達到滿意的效果。EPC的抑血管效應顯示出其在腫瘤治療中的潛力，成為腫瘤治療的一個新的發(fā)展方向。

Su等［15］通過對22例卵巢癌患者和15例健康受試者的循環(huán)EPC培養(yǎng)，研究EPC中DNA結(jié)合/分化抑制子1(inhibitor of DNA binding/differentiation 1，ID1)在卵巢癌患者血管新生中的作用以及其信號轉(zhuǎn)導通路，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌患者中，ID1通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶和NF-κB/基質(zhì)金屬蛋白酶2信號通路可以增加EPC的血管新生。推測如果運用特異性抑制劑阻滯這種通路可能將消除ID1對EPC的增強效應，從而抑制腫瘤的生長，預示了其在卵巢癌治療中的潛力。

慢性應激會促進腫瘤血管生成，然而其機制尚未完全闡明。Jiang等［16］假設(shè)，慢性應激通過交感神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)α1腎上腺素能受體誘導激活EPC細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和β2AR內(nèi)皮型一氧化氮合酶信號通路來增加腫瘤血管生成。這一假設(shè)尚需通過臨床和動物實驗予以確證。如果該假設(shè)得到驗證，將有可能對新的抗腫瘤藥物的研發(fā)產(chǎn)生影響。

Huang等［17］檢測前列腺癌細胞缺氧24和48 h條件培養(yǎng)基分泌細胞因子的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其增殖、遷移和血管發(fā)生能力等功能變化與相同培養(yǎng)條件下骨髓來源EPC一致，表明前列腺癌細胞在缺氧早期階段具有通過分泌細胞因子來調(diào)整自身微環(huán)境，以促進骨髓來源EPC遷移和血管生成的潛力。

針對部分乳腺癌患者在常規(guī)治療后長達數(shù)年甚至幾十年休眠后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，Ghajar等［18］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞誘導了持續(xù)靜止的乳腺癌細胞。穩(wěn)定的微血管系統(tǒng)構(gòu)成了腫瘤彌散細胞的休眠龕(dormant niche)，而腫瘤彌散細胞休眠龕的主要成分是基膜。由于乳腺癌細胞必須通過血源途徑以到達乳腺腫瘤最常轉(zhuǎn)移的部位如肺、骨髓、大腦和肝臟，所以微血管基膜將是腫瘤細胞擴散到這些組織遇到的第一道屏障。內(nèi)皮細胞和因子(例如凝血酶敏感蛋白-1)就沉積儲存在基膜周圍。通過器官微血管龕的蛋白質(zhì)組學和蛋白質(zhì)沉積物的功能分析，鑒定凝血酶敏感蛋白-1是內(nèi)皮衍生的腫瘤抑制基因。更重要的是，凝血酶敏感蛋白-1在萌芽的新生血管附近減少，表明在這種龕下腫瘤可能逃脫生長調(diào)節(jié)。說明內(nèi)皮細胞直接影響了乳腺癌細胞的增長。這些問題是設(shè)計通過支撐腫瘤細胞休眠，或用最小的劑量選擇性地殺滅休眠細胞來預防復發(fā)而避免損傷正常組織的關(guān)鍵。EPC作為內(nèi)皮細胞的前體細胞，亦能在預防乳腺癌復發(fā)中起到重要作用。

4.3 內(nèi)皮祖細胞作為基因載體用于腫瘤治療

基因治療是指將有治療作用的基因通過一定方式導入靶細胞以發(fā)揮作用，從而達到治療疾病的目的。基因治療的載體大致可分為病毒型載體和非病毒型載體。在過去多年的臨床試驗里，基因治療的效果不盡如人意，其中不良反應成為人們關(guān)注的主要問題。EPC作為載體，不僅無病毒型載體潛在的致癌性、自身免疫原性，無排斥反應［19］，且靶向性高，系統(tǒng)毒性低。Hamanishi等［20］通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將小鼠CC趨化因子配基19(CC chemokine ligand 19，CCL19)基因?qū)肱咛PC，此基因表達后可產(chǎn)生一種淋巴細胞遷移趨化因子。在B6C3F1型小鼠皮下接種小鼠卵巢癌HM-1型細胞，配合小鼠體內(nèi)注入導入CCL19基因的胚胎EPC，表現(xiàn)出免疫活性和腫瘤抑制效應。與對照組相比，胚胎EPCCCL19組荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤組織具有更多的CD8+淋巴細胞，顯示出了腫瘤抑制效應。Zhang等［21］將胸苷激酶基因修飾的EPC注入帶有神經(jīng)膠質(zhì)瘤的裸鼠體內(nèi)，配合更昔洛韋(ganciclovir)治療后，通過細胞凋亡和微血管密度的分析來評估其抗腫瘤效應。結(jié)果顯示，配合更昔洛韋治療后，胸苷激酶基因修飾的EPC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞顯示出潛在的旁觀者效應。通過多次靜脈注入胸苷激酶基因修飾的EPC，可抑制血管生成而產(chǎn)生抗腫瘤效應。Varma等［22］在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠模型內(nèi)利用EPC作為載體于腫瘤部位基因表達人鈉碘同向轉(zhuǎn)運體，并通過單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)檢測到了EPC的遷移及人鈉碘同向轉(zhuǎn)運體基因的表達。研究表明，EPC能夠作為基因載體對神經(jīng)膠質(zhì)瘤進行基因治療。

但是，在EPC的研究應用中仍然存在很多有待更深入研究的問題。一是尋找能真正代表EPC的具有較高特異性的表面標志物，目前還沒有某一類單獨的具有特異性的表面分子可以代表EPC;二是由于腫瘤的病理類型不同、腫瘤的不同分期，EPC的作用也存在差異，找到EPC在不同病理類型、不同腫瘤分期中的相應機制，能更好地指導臨床應用。

5 結(jié)語

EPS高度的增殖潛力和定向生成血管內(nèi)皮細胞的能力為腫瘤的研究和治療開辟了新途徑。臨床研究和動物實驗研究提示，EPC在應用于治療腫瘤和作為腫瘤生物標志物方面具有很大的優(yōu)勢。但EPC的臨床應用還處于探索性階段，尚未真正作為一種治療手段應用于臨床，相關(guān)機制研究還需更深入的研究。由于EPC的功能特性和優(yōu)勢，個性化治療方案可能為不同的患者提供更個性化的治療，在提高療效的同時可減輕患者因單純放、化療以及手術(shù)治療帶來的痛苦。

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