侯英健，史小琴，韓艷梅，李 惠，郭昊天

(河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000)

組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，特異性抑制外源性凝血途徑，是一種控制凝血啟動(dòng)的抗凝蛋白［1］。血栓形成是糖尿病的主要并發(fā)癥之一。糖尿病患者血糖持續(xù)升高，導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)的生成［2］。AGEs水平可上調(diào)組織因子，促進(jìn)血栓形成。作為控制糖尿病的一線(xiàn)用藥，二甲雙胍明顯緩解糖尿病并發(fā)癥［3］，但目前尚無(wú)其調(diào)節(jié)糖尿病血栓及TFPI表達(dá)的報(bào)道。本研究檢測(cè)了二甲雙胍對(duì)TFPI表達(dá)的影響，并初步探討了其中機(jī)制，為糖尿病血栓的干預(yù)提供了新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑 二甲雙胍(美國(guó)Sigma公司)，兔抗人 β-actin多克隆抗體及小鼠抗人TFPI單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 從人臍靜脈中分離原代內(nèi)皮細(xì)胞，種植于鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中，用含10% 胎牛血清的M199培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 糖基化牛血清白蛋白的制備 將牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖溶磷酸緩沖液中(pH 7.4)，過(guò)濾除菌后在37℃下孵育3個(gè)月。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TFPI mRNA的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用MxPro QPCR系統(tǒng)進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。β-actin作為內(nèi)參照。

1.2.4 Western blot方法檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后，加入適當(dāng)濃度的第一抗體(室溫孵育4 h)和第二抗體(室溫孵育1 h)后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TFPI mRNA水平 AGEs(50 mg·L-1)明顯下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TFPI mRNA表達(dá)(P＜0.01)。在AGEs刺激內(nèi)皮細(xì)胞的同時(shí)，給予二甲雙胍。結(jié)果表明，1 μmol·L-1的二甲雙胍對(duì)TFPI的表達(dá)無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用，而5與10 μmol·L-1的二甲雙胍均明顯逆轉(zhuǎn)AGEs對(duì)TFPI的抑制作用(P＜0.05)。

2.2 二甲雙胍上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TFPI蛋白表達(dá)水平 AGEs(50 mg·L-1)明顯下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TFPI蛋白表達(dá)，而二甲雙胍(5 μmol·L-1)明顯逆轉(zhuǎn)AGEs對(duì)TFPI的抑制作用。

3 討論

二甲雙胍不僅能夠有效控制血糖，還明顯抑制糖尿病血管并發(fā)癥。王景尚等［4］研究表明，其機(jī)制可能為二甲雙胍降低了血漿中 AGEs的水平。但是本課題組發(fā)現(xiàn)，即使在AGEs含量不發(fā)生改變時(shí)，二甲雙胍仍能夠通過(guò)調(diào)節(jié)其下游通路發(fā)揮抗凝作用。我們以AGEs刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)給予二甲雙胍處理。檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍部分阻斷了AGEs對(duì)TFPI表達(dá)的抑制作用。本課題組之前研究表明，AMPK上調(diào)TFPI表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗血栓的作用［5］，而二甲雙胍激活A(yù)MPK的作用已得到廣泛證實(shí)。因此我們推斷AMPK信號(hào)通路參與了二甲雙胍對(duì)TFPI的上調(diào)作用。

［1］Kato H.Regulation of functions of vascular wall cells by tissue factor pathway inhibitor:basic and clinical aspects［J］.Arterioscl Thromb Vasc Biol，2002，22:539-48.

［2］Xanthis A，Hatzitolios A，Koliakos G，et al.Advanced glycosylation end products and nutrition-a possible relation with diabetic atherosclerosis and how to prevent it［J］.J Food Sci，2007，72(8):R125-9.

［3］Whittington H J，Hall A R，McLaughlin C P，et al.Chronic metformin associated cardioprotection against infarction:not just a glucose lowering phenomenon［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2013，27(1):5-16.

［4］王景尚，殷惠軍，黃 燁，等.鹽酸二甲雙胍對(duì)2型糖尿病大鼠波動(dòng)性高血糖狀態(tài)下血管內(nèi)皮功能的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(5):686-90.

［4］Wang J S，Yin H J，Huang Y.Effects of metformin hydrochloride on the endothelial function of type 2 diabetes mellitus rats with high blood glucose fluctuation［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):686-90.

［5］侯英健，韓艷梅，史小琴，等.瑞舒伐他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中組織因子途徑抑制物表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(8):1146-9.

［5］Hou Y J，Han Y M，Shi X Q，et la.Effects of rosuvastatin on the expression of tissue factor pathway inhibitor in vascular endothelial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(8):1146-9.