李 韜 趙金偉 葛巨剛 李晨玉 (吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 300)

循環(huán)腫瘤細胞(CSC)是指自發(fā)或因醫(yī)療操作等人為因素進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。具有高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞在循環(huán)系統(tǒng)中生存下來，相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展成轉(zhuǎn)移灶，因此，檢測外周血中腫瘤細胞可以預(yù)警腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究采用RT-PCR技術(shù)分析外周血基因標(biāo)記物mRNA表達與癌性腸梗阻肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 收集吉林省人民醫(yī)院及吉林省腫瘤醫(yī)院2009年3月至2010年5月經(jīng)X線和(或)腹部CT確診的27例結(jié)腸梗阻病例，年齡68～82〔平均(75.3±6.7)〕歲，均經(jīng)手術(shù)治療，術(shù)中及術(shù)后確立診斷。20例為結(jié)直腸癌所致腸梗阻，7例為非癌性腸梗阻，20例癌性腸梗阻中有14例伴發(fā)肝臟轉(zhuǎn)移。抽取靜脈血5～10 ml放置于-80℃冰箱冰凍保存，備用。

1.2 外周血標(biāo)本的預(yù)處理 外周血單個核細胞(PBMC)采用聚蔗糖-泛影葡胺梯度離心法，分離吸出白膜狀界面細胞層，依次洗滌，離心后獲得PBMC，置于-80℃冰箱中保存。

1.3 總RNA提取 用焦碳酸二乙酯(DEPC)嚴(yán)格處理實驗器材以防RNA酶污染。解凍組織標(biāo)本或糞便預(yù)處理后的標(biāo)本，研磨后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，1 000 r/min，5 min，棄上清;加1 ml Trizol，室溫放置5 min，轉(zhuǎn)到EP管加0.2 ml氯仿重懸沉淀，劇烈振搖，室溫靜置5 min;4℃12 000 r/min，離心15 min;上層水相移至另一EP管，加入0.5 ml冰異丙醇充分混勻，室溫放置 10 min，4℃ 12 000 r/min，離心 15 min，去上清，加入75%冰乙醇-DEPC 1 ml，振搖洗滌沉淀，4℃ 12 000 r/min，離心10 min，棄上清;去乙醇，空氣中干燥 RNA，加DEPC水10～50 μl，溶解RNA，所得的總RNA置于-80℃冰箱保存。

1.4 RNA純度及完整性檢測 取RNA樣品用紫外-可見光分光光度計于260 nm、280 nm處測定A值，計算RNA濃度和RNA定量。取RNA樣品進行甲醛變性，1%瓊脂糖凝膠電泳，拍照，用光密度掃描儀掃描28 s和18 s條帶，計算密度比值。

1.5 RT-PCR技術(shù)檢測mRNA表達 實驗所需引物及內(nèi)參照β-肌動蛋白(β-actin)引物均系上海生工生物工程公司合成，經(jīng)GenBank檢索為特異性引物〔1〕。DNA Marker采用寶生物工程有限公司 DL2000 Marker。(1)逆轉(zhuǎn)錄:RNA 4 μl+OligodT 2 μl+DEPC 10 μl，72℃，5 min，變性模板 RNA，迅速放置冰上，復(fù)性模板 RNA。5倍緩沖液 5 μl+10 mmol/L dNTP 2 μl+25 U/μl Rnasin 1 μl+200 U/μl MMLV 1 μl，42℃，1 h，94℃，5 min，放于冰上，5 min，置-80℃儲存。(2)PCR反應(yīng)體系:滅菌去離子水 32 μl，10 × PCR 緩沖液 5 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，10 pmol 上游 引物 1 μl，10 pmol 下游 引物 1 μl，cDNA(0.1 μg/μl)1 μl，Taq DNA 聚合酶(2 U/μl)0.2 μl。擴增條件:β-actin:取 cDNA 2 μl，加入 10 倍緩沖液 2 μl，25 mmol/L 氯化鎂溶液 1.2 μl，Taq 酶1 U，22.5 mmol/L dNTPs 0.16 μl，β-actin引物0.1 μg，加去離子水至20 μl進行PCP擴增。每次設(shè)一管不加樣品 cDNA為陰性對照。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30 個循環(huán)，72℃延長7 min?；驍U增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含0.1%溴乙啶)電泳，拍照。環(huán)氧合酶2(COX-2)，肌酸激酶(CK-20)及CD44v6:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，加入10 × PCR 緩沖液3 μl，COX-2 引物 20 pmol，β-actin 引物 4 pmol，Taq DNA 酶1 U，DEPC處理水至30 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共45個循環(huán)?；驍U增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含0.1%溴乙啶)電泳，拍照。圖片中出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶為mRNA表達陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0軟件行χ2檢驗。

2 結(jié)果

伴肝轉(zhuǎn)移的14例病人中，85.7%(12/14)的病人外周血中至少有一種基因mRNA表達陽性;而在非轉(zhuǎn)移的6例病人中，16.7%(1/6)陽性表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003 0)。

聯(lián)合檢測外周血中COX-2，CK-20及CD44v6 mRNA表達預(yù)測肝轉(zhuǎn)移的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確性分別為85.7%，83.3%，92.3%，71.4%、85.0%。

3 討論

由于機體免疫系統(tǒng)的識別和機械性殺傷作用和腫瘤細胞自身因素，大多數(shù)進入循環(huán)的腫瘤細胞發(fā)生凋亡，不能形成轉(zhuǎn)移灶，這種現(xiàn)象稱之為“無效轉(zhuǎn)移”〔2〕。只有極少數(shù)具有高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞在循環(huán)系統(tǒng)中生存下來，相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展成轉(zhuǎn)移灶。因此，檢測外周血中腫瘤細胞可以預(yù)警腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。RT-PCR技術(shù)被認(rèn)為是目前檢測最有效的方法，以腫瘤和上皮組織中某些物質(zhì)的mRNA為標(biāo)記物檢測結(jié)直腸癌CSC。Kopreski等〔3〕首次采用RT-PCR方法檢測到黑色素瘤患者血漿中酪氨酸酶的mRNA，結(jié)果證實RT-PCR方法檢測外周血CSC mRNA切實可行。采用RT-PCR及其他各種改進的RT-PCR技術(shù)，使用不同的標(biāo)記物，可從105～107個循環(huán)細胞中檢測出1個腫瘤細胞，常用的標(biāo)記物有端粒酶 mRNA、CK mRNA、CD44v mRNA、EGFR mRNA 等，當(dāng)以單一腫瘤標(biāo)記物的mRNA為標(biāo)記物，易受到假基因的干擾，造成假陽性的原因是組織特異性基因在非特異性基因細胞內(nèi)的非法轉(zhuǎn)錄等，易導(dǎo)致假陰性的原因是循環(huán)腫瘤細胞間斷釋放入血以及RNA酶降解的特點。Hsieh等〔4〕對118例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和血清中K-ras、P53及APC基因突變采用PCR-SSCP方法進行檢測，并對擴增的基因組DNA直接測序檢查。Hibi等〔5〕對44例結(jié)直腸癌患者進行寡核苷酸錯配檢測，確定了血清中DNA的遺傳變異特性，16例腫瘤組織及血標(biāo)本中同樣檢測到了K-ras基因突變，在腫瘤組織內(nèi)檢測到P53基因突變的10例患者中，有7例患者血標(biāo)本中也檢測到了同樣的基因突變，其中5例處于早期病變(P=0.01)，23%結(jié)直腸癌患者血清中P53或K-ras基因突變，結(jié)直腸癌早期患者血清出現(xiàn)高比例的P53基因突變提示其可以作為檢測的標(biāo)記物。Hardingham等〔6〕對結(jié)直腸癌患者采用PCR檢測K-ras基因突變，發(fā)現(xiàn)K-ras 12位點突變與生存期和復(fù)發(fā)率相關(guān)，突變者生存率降低，復(fù)發(fā)率增加。由于DNA在循環(huán)中較為穩(wěn)定，使用DNA檢測得到的可能只是循環(huán)內(nèi)的腫瘤負(fù)荷，而不是有活力的腫瘤細胞，近年來其應(yīng)用逐漸減少，而以腫瘤或上皮組織特異性mRNA為檢測對象的RT-PCR方法近年來應(yīng)用最為廣泛。Shen等〔7〕通過比較腫瘤及健康對照組的CSC檢出率，發(fā)現(xiàn)良性腫瘤組及健康對照組CSC陽性率明顯低于癌癥組。在Dukes A、B期，Dukes C期及Dukes D期三組間CSC陽性率差異具有顯著性，且CSC陽性率高的患者肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。Uen等〔8〕對行腫瘤根治性手術(shù)患者術(shù)前1 w和術(shù)后1 w外周血CSC進行檢測，發(fā)現(xiàn)術(shù)后 UICC分期 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者陽性率分別為6.0%、30.3%和41.3%，而對應(yīng)的術(shù)后復(fù)發(fā)率分別為2.3%、28.7%和39.7%，且CSC持續(xù)陽性提示患者術(shù)后生存期短。總之，在一般情況下，早期(Ⅰ、Ⅱ期)患者CSC陽性率較低，中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)患者陽性率較高。RT-PCR檢測方法與免疫組織化學(xué)法相比敏感度更高〔9〕，而且多項指標(biāo)聯(lián)合檢測的陽性率明顯高于單項指標(biāo)，手術(shù)和化療會使CSC計數(shù)減少，甚至轉(zhuǎn)陰。

1 趙金偉，李 韜，馬 震，等.大腸癌原發(fā)灶及糞便標(biāo)本中基因mRNA表達及其臨床意義〔J〕.中國實驗診斷學(xué)，2012;16(8):1391-4.

2 Hunter K.Host genetics influence tumor metastasis〔J〕.Nat Rev Cancer，2006;6(2):141-6.

3 Kopreski MS，Benko FA，Kwak LW，et al.Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma〔J〕.Clin Cancer Res，1999;5(8):1961-5.

4 Hsieh JS，Lin SR，Chang MY，et al.APC，K-ras and p53 gene mutations in colorectal cancer patients:correlation to clinicopathologic features and postoperative surveillance〔J〕.Am Surg，2005;71(4):336-43.

5 Hibi K，Dobinson CR，Booker S，et al.Molecular detection of genetic alterations in the serum of colorectal cancer patients〔J〕.Cancer Res，1998;58(7):1405-7.

6 Hardingham JE，Hewett PJ，Sage RE，et al.Molecular detection of bloodbone epithelial cells in colorectal cancer patients and in patients with benign bowel disease〔J〕.Int J Cancer，2000;89(1):8-13.

7 Shen C，Hu L，Xia I，et al.Quantitative real-time RT-PCR detection for survivin，CK20 and CEA in peripheral blood of colorectal cancer patients〔J〕.Jpn J Clin Oncol，2008;38(11):770-6.

8 Uen YH，Lu CY，Tsai HL，et al.Persistent presence of postoperative circulating tumor cells is a poor prognostic factor for patients with stageⅠ-Ⅲ colorectal cancer after curative resection〔J〕.Ann Surg Oncol，2008;15(8):2120-8.

9 Leather AJ，Gallegos NC，Kocian G，et al.Detection and enumeration of circulating tumour cells in colorectal cancer〔J〕.Br J Surg，1993;80(6):777-80.