許 群 眭 建 (江蘇大學臨床醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

侵襲性真菌感染近年有明顯的上升趨勢，其主要原因是臨床上長期使用廣譜抗生素、免疫抑制劑，放化療的綜合應用及艾滋病的流行，致使人體的正常菌群失調，機體免疫功能減低，外源性真菌乘虛侵入或內源性真菌在體內生長繁殖而引發(fā)感染〔1〕。國內外報道引起感染的真菌種類主要有念珠菌、曲霉菌、隱球菌、毛霉菌等，其中白念珠菌的感染最多見〔2，3〕。白念珠菌致病具有多變性，包括念珠菌血癥、外陰陰道念珠菌病(VVC)〔4〕、皮膚黏膜念珠菌病、臟器感染等，其中呼吸道感染發(fā)病率最高〔2〕。侵襲性肺部真菌感染的臨床及影像學表現缺乏特異性，難以獲得組織和病原學的證實，病情易被原發(fā)病或其他并發(fā)癥掩蓋，造成誤診、漏診，從而延誤治療;未及時處理的肺部真菌感染患者的病死率可達30% ～80%〔5〕。因此，建立相應的真菌模型用于研究相關指標，指導臨床實踐，能為改善真菌感染現狀提供可能。

1 模型的建立

目前用于白念珠菌模型研究的動物主要有小鼠、大鼠、豚鼠、兔及基因敲除鼠。實驗動物白念珠菌感染途徑主要有經口腔灌喂、呼吸道、陰道、腹腔及靜脈系統(tǒng)途徑接種。肺部真菌感染的模型，大多數通過呼吸道建立，如氣管切開接種法和滴鼻法，也有采用靜脈接種建立系統(tǒng)性感染模型。有研究者采用密閉空間分生孢子吸入感染的方法，成功建立了免疫抑制小鼠的肺部曲霉菌感染模型〔6〕。其中，經氣管切開接種法建立的模型雖成功率較高，但是操作繁瑣且實驗動物傷害嚴重，對動物耐受性要求高。

2 白念珠菌致病機制

2.1 宿主因素 真菌極少引起健康和具有免疫能力的個體的疾病，即使不斷暴露于具有傳染力的繁殖體。宿主主要通過多種不同的保護機制來阻止真菌入侵，皮膚黏膜的完整性，機體自身產生的長鏈不飽和脂肪酸，標準菌落的pH競爭，上皮更新及角質層的自然干燥阻止了真菌的生長。其他組織像毛細支氣管，胃腸道和陰道穹窿則通過體液中的黏膜上皮細胞含有的抗菌物質或通過纖毛清除異物起作用。

白念珠菌是引起侵襲性真菌感染最主要的病原菌。新生兒在分娩過程中通過陰道腔時最先接觸白念珠菌，在此過程中念珠菌便寄生在新生兒的口腔前庭和部分胃腸道內，并終生攜帶，但是在正常機體內一般不致病。當白念珠菌在偶然穿過宿主的皮膚和黏膜屏障且感染的數量及毒力到達一定程度，或者宿主免疫缺陷時，才會引起機體感染。細胞免疫缺陷的病人皮膚黏膜易感染，但并不發(fā)展成念珠菌血癥，相反全身性的感染更易發(fā)生在嗜中性白細胞減少癥或嗜中性粒細胞失調的病人〔7〕。局限于肺部的白念珠菌病少見，常見的是念珠菌血癥引起的多臟器念珠菌病，并包括肺部。

2.2 菌體因素 有研究表明〔8〕，白念珠菌致病主要與黏附能力、受體形態(tài)轉化、胞外酶等有關，其分泌的毒素和水解酶，有破壞組織的能力。念珠菌黏附到宿主細胞表面是致病的首要條件，菌體可廣泛黏附于上皮細胞、血管內皮細胞及細胞外基質等通過多種途徑引起局部或播散性感染〔9〕。白念珠菌可存在于多種形態(tài)，包括菌絲、假菌絲和酵母形式，從酵母到絲狀形態(tài)過渡的能力與毒力相關〔10〕。細胞外水解酶中，分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)是潛在的毒力因素，已知SAP能降解細胞外基質、角蛋白及免疫球蛋白等，為白念珠菌提供營養(yǎng)，并促進白念珠菌黏附上皮細胞，侵入宿主造成組織損傷及協助其逃逸宿主防御機制〔11〕。另外〔12〕，念珠菌菌體成分可激活補體旁路途徑，產生補體趨化因子和過敏毒素，導致局部水腫和炎細胞浸潤。真菌腺嘌呤環(huán)化酶Cyr1p是cAMP/PKA信號傳導通路的一個關鍵組成部分，該通路控制著不同的相關感染性狀，包括菌絲的形態(tài)形成。然而，目前有關血清菌絲誘導特點及其真菌傳感器的機制仍屬未知。Xu等〔13〕的分析結果表明，活化血清的組分中含有細菌的類肽聚糖(PGN)分子，而有幾個純化和合成的胞壁酰二肽(MDPs)與細菌的類肽聚糖的亞基能夠有效地促進白念珠菌的菌絲生長。通常情況下，核苷酸結合寡聚化結構域蛋白Nod1和Nod2可以通過富含亮氨酸的重復序列(LRR)域識別 PGN的類似物，研究者發(fā)現，胞壁酰二肽(MDPs)可以通過直接與其LRR域結合來激活Cyr1p。另有研究發(fā)現亦可直接激活Cyr1p催化結構域〔14〕。

3 白念珠菌肺部感染動物模型的應用

3.1 免疫學研究 在機體抗真菌感染中，病原識別受體(PRR)對其進行識別并啟動固有免疫，Toll樣受體(TLRs)是最重要的PRR之一。真菌侵入機體后，主要由TLR2和TLR4等通過識別不同的病原相關分子模式(PAMPs)，啟動固有細胞免疫，巨噬細胞和中性粒細胞被激活并釋放細胞因子和炎癥介質。TLR4主要識別白念珠菌壁上的甘露聚糖啟動信號傳導，而TLR2則主要識別β-葡聚糖介導細胞因子的分泌〔15〕。有研究發(fā)現〔16〕感染白念珠菌的TLR4缺陷小鼠，巨噬細胞表現出較低的吞噬作用并且趨化因子CXCL1、白介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平較低，表明TLR4對巨噬細胞識別白念珠菌的感染至關重要。

宿主巨噬細胞通過呼吸爆發(fā)和釋放細胞因子吞噬并殺滅入侵的白念珠菌，而抗原遞呈細胞(APCs)對念珠菌抗原進行加工并遷移至淋巴結，在MHC-Ⅱ類分子的作用下向CD4+T亞群細胞分化，進而進一步分化為TH 1和TH 17型細胞〔7〕。白介素-17(IL-7)是TH 17細胞產生的最主要的細胞因子，研究發(fā)現人外周血中分泌的IL-17為CCR6+CD4記憶性T細胞，通過對其細胞抗原特異性的分析，TH 17細胞可能在真菌感染中發(fā)揮重要作用〔17〕。IL-17可以產生類似于 IL-1β、TNF-α或脂多糖(LPS)的作用，誘導炎癥反應的細胞因子產生，IL-17A敲除的小鼠，其嗜中性粒細胞到達感染組織的數量減少〔18〕。在大鼠支氣管肺白念珠菌感染模型的研究中，發(fā)現IL-17的水平與機體炎癥反應呈正相關，可能通過促進中性粒細胞在氣道的聚集參與炎癥反應〔19〕。TH 1細胞分泌的 γ-干擾素(IFN-γ)與白介素-12(IL-12)，可激活巨噬細胞并加強機體對再感染念珠菌的抵抗力。另外，CD4+th1還可誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應，控制真菌感染的擴散。傅穎媛等〔20〕研究發(fā)現，在Balb/c小鼠白念珠菌感染早期多以TH 1型細胞應答為主，后期TH 1/TH 2型細胞因子均升高，示體液免疫也參與了機體抗感染。

3.2 指導臨床診斷 Mitra等〔10〕報道了一種新的進行性白念珠菌系統(tǒng)性感染的成像模型，試驗者在小鼠體內接種標記了綠色熒光蛋白(GFP)的白念珠菌，能在共焦顯微鏡下顯示體內形成的系統(tǒng)性感染狀態(tài)，進而觀察到絲狀體的生長及微膿瘍在小鼠體內的形成。謝麗璇等〔21〕發(fā)現在免疫抑制的新西蘭兔肺白念珠菌病模型中，胸部CT表現多樣，其中實變最多見，其次為磨玻璃、結節(jié)影，各種征象可單獨發(fā)生，亦可組合發(fā)生，為臨床影像學診斷肺部白念珠菌感染提供了參考。

3.3 疫苗研制 目前認為治療白念珠菌除了抗真菌藥物外，還需使機體處于高免疫狀態(tài)，有效的疫苗可以大大降低真菌感染率和死亡率。疫苗要應用于臨床，必須首先在動物模型上進行大量的實驗來證實其有效性。近年來研究的白念珠菌疫苗主要有:菌體滅活疫苗，但效果并不十分有效;DNA疫苗，其免疫原性并不清楚，主要還處于動物研究階段;亞單位疫苗，即將念珠菌中的特異性抗原進行提純，制成疫苗。另外還有P43疫苗、殺傷細胞毒素疫苗及以DC為基礎的“佐劑”型疫苗等，但對于疫苗的作用機制和人體安全性仍然需要進一步研究〔22，23〕。李麗波等〔24〕在進行系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠研究中，發(fā)現卡介苗提前免疫組的存活期時間及腎組織菌落計數較生理鹽水對照組有明顯改善。

3.4 抗真菌藥物實驗 目前較有效的抗真菌藥物有氟康唑、兩性霉素B脂質體、伊曲康唑、卡泊芬凈及米卡芬凈等，臨床上大多根據經驗用藥。但由于現有藥物的不良反應、大量耐藥白念珠菌菌株和新菌株的出現以及復發(fā)率的上升，使得研究和開發(fā)新型藥物不容松懈。細胞因子作為一種抗真菌感染的輔助治療因子，已經受到越來越多研究者的關注。IFN-γ、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-12及TNF-α在動物感染模型中有較好的抗菌作用。特別是抗真菌藥與細胞免疫因子聯合應用時不僅能提高療效，而且還能降低耐藥性和潛在毒性〔25〕。最近，Tsai等〔26〕研究發(fā)現白介素-37(IL-37)能通過優(yōu)先結合白念珠菌細胞壁上的主要成分甘露聚糖來發(fā)揮對菌體黏附和聚集的抑制作用，為防治白念珠菌感染提供了一種新的策略。在抗白念珠菌感染的研究中，越來越多的中藥被發(fā)現有較好的抗真菌作用，有試驗者〔27〕發(fā)現大蒜素注射液能提高正常感染及免疫抑制感染狀態(tài)下小鼠脾臟T淋巴細胞的增殖活性和IFN-γ水平。另在參芪扶正液輔助治療肺白念珠菌感染的實驗研究中，發(fā)現其與抗真菌藥伍用可提高感染小鼠的生存率，增強抗真菌藥物的療效〔28〕。

4 討論

在白念珠菌感染的研究中，動物模型廣泛被應用，并也取得了一定的成果，但多是研究真菌的致病機制及抗真菌藥物的研發(fā)。而臨床上侵襲性肺部真菌感染沒有特征性，易被原發(fā)病或繼發(fā)細菌、病毒感染的表現掩蓋，且與其他肺部感染疾病的鑒別診斷不明確，早期診斷十分困難。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)陽性率較低且耗時長，即使陽性有時也難以確定是定植、污染或感染;病理學檢查結果雖可靠，但屬于有創(chuàng)檢查，患者較難接受。一些新興的血清學和分子生物學診斷方法雖可用于早期診斷，但是敏感性和特異性的結果并不理想。肺部真菌感染的病人經確診時往往感染較嚴重，加之本身機體狀態(tài)比較差，故感染較難控制。發(fā)病率和死亡率居高不下的現狀迫切需要新的診斷方法來獲取更多的信息，譬如借助動物模型進行疾病的發(fā)展過程和影像學等方面的研究，進一步完善各項指標，建立一個標準化的診斷和治療方案。

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