楊永霞，馮琦,王景，崔紅，劉國順

煙草行業(yè)栽培重點實驗室 河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州市文化路95號 450002

植物中的類胡蘿卜素是生物體內(nèi)通過類異戊二烯途徑合成，主要是含有40個碳原子的萜類色素物質(zhì)。類胡蘿卜素在光合作用中擔負著光吸收輔助色素的重要功能，起著提高光合效率、保護光合器官、防止光氧化損傷等的重要作用[1-2]。類胡蘿卜素類物質(zhì)包含很多具有鮮艷色彩的色素物質(zhì)，可以賦予植物花和果實等器官絢麗的色彩，在植物長期的進化和發(fā)育過程中具有重要作用。此外，植物類胡蘿卜素還是許多生理活性物質(zhì)，如植物激素(ABA，獨腳金內(nèi)酯等)、防御化合物和風味芳香物等生物合成的前體[3-6]，因此，研究類胡蘿卜素具有重要的現(xiàn)實意義。關(guān)于植物類胡蘿卜素的生物合成及其遺傳操作已有詳細綜述[7]，本文對煙草有關(guān)的合成及遺傳調(diào)控做簡單介紹，重點對煙草類胡蘿卜素降解途徑進行詳細綜述。

1 類胡蘿卜素的代謝途徑

1.1 類胡蘿卜素的生物合成

過去的若干年里，對于植物類胡蘿卜素的生物合成已經(jīng)有較深入的研究。與編碼綠色植物類胡蘿卜素生物合成相關(guān)酶類的基因和cDNA都已經(jīng)進行了鑒定或測序[8]，編碼的蛋白質(zhì)等產(chǎn)物的特性也進行了相關(guān)分析，這為基因工程改良作物中類胡蘿卜素的種類及含量奠定了重要基礎(chǔ)。煙草中存在的類胡蘿卜素主要有八氫番茄紅素、葉黃素、a，β-胡蘿卜素、新葉黃素和葉紅素等。煙草中類胡蘿卜素在質(zhì)體中合成，其前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸(IPP)通過3-磷酸甘油醛/丙酮酸途徑合成類胡蘿卜素，其生物合成主要是先合成前體物 IPP在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶( isopentenyl pyrophosphate isomerase，IPI) 催化下生成其異構(gòu)體異戊二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，IPP可與DMAPP縮合形成牻牛兒基焦磷酸，在牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GPPS)催化下再與2個IPP合成牻牛兒牻牛兒基焦磷酸(GGPP)，GGPP是植物多種物質(zhì)生物合成的共同前體。然后2分子的GGPP由八氫番茄紅素合成酶((phytoene synthase, PSY)催化形成無色的八氫番茄紅素。后者在八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene desaturase, PDS)和ζ-胡蘿卜素脫氫酶 (ζ-carotene desaturase, ZDS)的作用下形成紅色的番茄紅素。番茄紅素經(jīng)番茄紅素β-環(huán)化酶 (lycopene-β-cyclase, LCYB)和番茄紅素 ε-環(huán)化酶(lycopene-ε-cyclase, LCYE)催化環(huán)化，形成2個β環(huán)的β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素，這是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵分支點。α-胡蘿卜素在類胡蘿卜素異構(gòu)酶(carotenoid isomerase, crtISO)的作用下結(jié)構(gòu)發(fā)生異構(gòu)化最終形成葉黃素。β-胡蘿卜素在β-環(huán)羥化酶(carotene hydroxylase, crtRB)的作用下羥基化反應(yīng)形成玉米黃素。再經(jīng)玉米黃素環(huán)氧酶(zeaxanthin epoxidase, ZEP)催化形成堇菜黃素。類胡蘿卜素代謝途徑中涉及的基因和酶很多，其中，IPI、GPPS、PSY 和PDS等都是類胡蘿卜素合成途徑重要的關(guān)鍵限速酶[8]。已發(fā)現(xiàn)，IPI和PSY的過量表達會導致類胡蘿卜素含量的增加[9]。Livingstone等對番茄、辣椒以及柑橘等6個物種的PSY、ZDS、LYCB以及ZEP序列進行分子進化比較分析發(fā)現(xiàn)，PSY、ZDS和LYCB所受的選擇壓力類似，尤以LYCB的同義替換速率最高；而ZEP的非同義替換速率最高[10]。說明類胡蘿卜素合成途徑中上游的基因處于強烈的選擇壓力限制之下，進化速率較慢，下游的基因處于放松的選擇壓之下，進化速率更快。

1.2 類胡蘿卜素的降解

煙草類胡蘿卜素是煙葉重要致香物質(zhì)的前體物，其降解產(chǎn)物的種類及含量直接決定著煙葉以及煙草類食用香精香料的品質(zhì)[11]。因此，目前對煙草類胡蘿卜素研究的焦點集中在煙草致香物質(zhì)上面。在煙葉總揮發(fā)性香氣成分中，類胡蘿卜素降解產(chǎn)生的茄酮和β-大馬酮等香味物質(zhì)刺激性較小，香氣質(zhì)較好，對煙葉香氣貢獻率大，是影響煙葉香氣質(zhì)和香氣量的重要組分。同時，類胡蘿卜素具有提高光合效率、抑制和清除自由基的作用[1]，對改善煙葉品質(zhì)和降低煙氣自由基傷害也具有重要意義。因此，在卷煙產(chǎn)品開發(fā)以及煙草類香精香料提取工業(yè)中，類胡蘿卜素及其降解產(chǎn)物的種類和含量，是卷煙配方設(shè)計和煙葉原料調(diào)香配方形成香氣風格的重要化學組分，也是今后烤煙生產(chǎn)和研究中需加以重點關(guān)注的指標。

相對于類胡蘿卜素的生物合成，類胡蘿卜素的降解過程，研究卻相對較少。類胡蘿卜素的降解可能主要是由光敏氧化作用引起，降解過程是否由酶催化、其具體的生化機制等問題，還有待進行深入研究。目前，對于氮磷鉀肥及水分因子對烤煙葉片類胡蘿卜素類物質(zhì)葉黃素的綜合影響[12]，烤煙成熟過程中類胡蘿卜素變化與其降解香氣物質(zhì)的關(guān)系[13]，以及脂氧合酶(LOX)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)對類胡蘿卜素降解的生理影響已有研究[14]。但是，對于參與類胡蘿卜素降解過程的關(guān)鍵基因及其功能和調(diào)控機制還未有報道，對于不同品種呈現(xiàn)不同香氣類型的分子機理研究也較少。因此，了解煙草類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因在類胡蘿卜素降解及累積中的作用，對于調(diào)節(jié)類胡蘿卜素代謝途徑，調(diào)控類胡蘿卜素及其降解產(chǎn)物的種類和含量，改良煙葉香氣質(zhì)量風格、降低煙草對人體健康的影響具有重要的現(xiàn)實意義。

對于其它模式植物類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因的研究可以為研究煙草類胡蘿卜素降解提供借鑒。已發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素裂解雙氧合酶（carotenoid cleavage dioxygenases, CCDs）可催化裂解很多類胡蘿卜素底物生成許多天然活性化合物（apocarotenoids），包括生長調(diào)節(jié)劑、色素、風味和芳香味物質(zhì)、防御化合物等，是類胡蘿卜素降解過程的關(guān)鍵酶[1,15]。CCD由一個古老的基因家族編碼，在細菌、植物和動物中都存在CCD基因。在長期的進化過程中，CCD基因家族形成了幾個顯著的特性：比如都需要Fe2+催化；均包含 4 個保守的與Fe2+結(jié)合有關(guān)的組氨酸殘基；C 端含有該基因家族保守的信號肽序列等[16-17]。模式植物擬南芥包含 9 種CCD基因，其它植物中的CCD均是根據(jù)與擬南芥的同源性進行命名。其中，有 5 種與ABA的合成有關(guān)，對植物的耐旱性起重要作用[18]，它們編碼的酶偏好底物為9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素(nine-cis-epoxycarotenoids), 堇菜黃素(violoxanthin)或者新葉黃素 (neoxanthin)，對底物的 11-12/11’-12’位雙鍵具有特異性裂解作用，被單獨命名為NCED (包括NCED2, 3, 5, 6, 9)，其余 4 個被命名為CCD (包括CCD1,4,7,8)。植物中，CCD催化的類胡蘿卜素底物非常豐富，類胡蘿卜素降解時因雙鍵斷裂部位不同，可產(chǎn)生不同碳原子數(shù)的化合物，進一步形成許多重要的香氣物質(zhì)。擬南芥CCD1 和CCD7可以裂解底物的9-10/9’-10’位雙鍵，胭脂樹BoLCD可裂解番茄紅素的5-6/5’-6’位雙鍵[19]，番紅花CsZCD可裂解玉米黃質(zhì)的7-8/7’-8’位雙鍵[20]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不同的CCD基因功能各異。其中，CCD1基因催化類胡蘿卜素類物質(zhì)降解產(chǎn)生的醛類和酮類物質(zhì)，比如β-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮、牻牛兒醛、香葉基丙酮以及 α-和 β-大馬酮等，是植物中重要的香氣物質(zhì)來源，對于植物的生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)以及品質(zhì)具有重要作用[15]。CCD4可以對稱裂解類胡蘿卜素類底物的9-10/9’-10’雙鍵生成C13酮類物質(zhì)。對菊花的研究發(fā)現(xiàn)，CCD4基因可以降解β-胡蘿卜素生成β-紫羅蘭酮，而且與白色花的形成有關(guān)[21]，但是蘋果、木犀等植物的CCD4則沒有此功能，而且不同植物甚至同一物種的CCD4的基因結(jié)構(gòu)差異很大，可分為有無內(nèi)含子兩種類型[22-23]。擬南芥、矮牽牛和豌豆等植物的CCD7和CCD8則與抑制側(cè)枝生長的獨腳金內(nèi)酯的合成有關(guān)[16,24-25]。對幾個單子葉和雙子葉植物的CCD7和CCD8所受的選擇壓力分析發(fā)現(xiàn)，CCD7和CCD8非常保守，沒有檢測到正選擇作用存在[26]。

幾種CCD基因中，CCD1基因的作用機制最為復雜。近來，擬南芥CCD1基因的同源物已經(jīng)從葡萄、油桃、番茄、矮牽牛以及番紅花等植物中得到分離[20,27-30]。在不同的植物中，CCD1編碼的酶具有底物降解偏好性和功能特異性。對玉米的研究表明，CCD1 可以裂解類胡蘿卜素的 9-10/9’-10’ 和 5-6/5’-6’位雙鍵生成C13和C8酮類物質(zhì)，這包括催化裂解ζ-胡蘿卜素生成香葉基丙酮、番茄紅素生成甲基庚烯酮、δ-胡蘿卜素生成α-紫羅蘭酮、β-胡蘿卜素生成β-紫羅蘭酮等[31]；而水稻CCD1可以裂解番茄紅素的5-6/5’-6’位雙鍵生成假性紫羅蘭酮、甲基庚烯酮和牻牛兒醛等C10類物質(zhì)[32]；番紅花CCD1催化7-8/7’-8’位雙鍵裂解玉米黃質(zhì)生成3-羥基-β-紫羅蘭酮[20]；擬南芥以及番茄CCD1主要偏好底物則為β-胡蘿卜素。在黃金稻米胚乳中過表達CCD1基因發(fā)現(xiàn)CCD1以apocarotenoids為底物[33]。因此，應(yīng)對不同植物的CCD1基因分別進行詳細深入的研究才能逐步了解類胡蘿卜素降解的共性機制。目前，NCBI數(shù)據(jù)庫中除煙草Nicotiana langsdorffiix Nicotiana sanderae雜交種CCD1的部分序列外，還沒有相關(guān)基因克隆的報道。我們已經(jīng)得到煙草品種K326CCD1基因的全序列，功能研究正在進行中。

2 煙草類胡蘿卜素代謝的調(diào)節(jié)

煙草類胡蘿卜素代謝屬于植物類異戊二烯合成代謝的一部分。類異戊二烯合成代謝是一個極其復雜而龐大的代謝系統(tǒng)，受到發(fā)育階段和生長環(huán)境等諸多因素的影響。煙草中類胡蘿卜素生物合成是在葉綠體中完成的，然而其合成酶類卻是核基因編碼的，并在胞質(zhì)中翻譯成酶的前體，最后通過轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入葉綠體。因此，類胡蘿卜素生物合成的調(diào)節(jié)在合成酶基因的表達、翻譯、轉(zhuǎn)運等階段都可以進行。通過對類胡蘿卜素生物合成和降解途徑中上下游關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)，已經(jīng)取得很多有意義的結(jié)果。比如煙草中過表達葡萄R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子(VvMYB5b)會導致植株矮小、葉的形態(tài)改變，種子萌芽能力減弱，β-胡蘿卜素量上調(diào)[34]。此外，高等植物的類胡蘿卜素是光合作用天線系統(tǒng)和反應(yīng)中心葉綠素結(jié)合蛋白的重要組成部分，因此環(huán)境因子對體內(nèi)類胡蘿卜素生物合成基因的表達也有明顯的影響。研究表明，紫外線(UV-B)照射后，煙草葉片中的類胡蘿卜素含量上升，其合成關(guān)鍵酶類的表達量顯著提高[35]。另外發(fā)現(xiàn)，煙草體內(nèi)過表達細菌脫氫酶基因crtZ可增加β-胡蘿卜醇類化合物的含量，提高煙草對紫外線的耐受能力[36]。除此之外，一些抑制劑可以有效的抑制類胡蘿卜素的生物合成[37]。

對植物類胡蘿卜素降解的調(diào)節(jié)機制報道較少，有待更加深入的研究。干旱以及一些倍半萜類抑制劑也可以通過增加或抑制NCED的合成，進而調(diào)節(jié)ABA的生物合成[38-39]，而對其它幾種CCD的調(diào)節(jié)卻未見相關(guān)報道。

3 煙草類胡蘿卜素基因工程研究進展

煙草是較為理想的模式作物，易于進行遺傳轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)，是類胡蘿卜素遺傳研究及植物基因工程改良的常用材料。Busch等于2002年從煙草中克隆了PSY和PDS，并對其在類胡蘿卜素代謝過程中的功能進行了研究。發(fā)現(xiàn)，過表達PSY-1 和PSY-2 會導致轉(zhuǎn)基因植株矮化、葉形改變和色素積累發(fā)生改變，而反義表達PSY和PDS則出現(xiàn)致死表型[40]。Kumagai 等將番茄PSY基因正義導入野生本氏煙草，植株呈現(xiàn)亮橙色，葉片中積累八氫番茄紅素，反義導入番茄PDS基因出現(xiàn)白色表型，同樣積累大量八氫番茄紅素[41]。Mann等將雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）的β-胡蘿卜素酮化酶基因CrtO導入普通煙草超量表達，導致煙草花的蜜腺有色體中積累以超強抗氧化劑蝦青素為主的酮類類胡蘿卜素，蜜腺的顏色也由黃變紅[42]。這一研究結(jié)果揭示了外源β-胡蘿卜素酮酶能夠與植物中的β-羥化酶一起產(chǎn)生蝦青素等酮基類胡蘿卜素，這為以后在其它植物中進行類似的操作提供了有益借鑒。

此外，類胡蘿卜素是 ABA 生物合成的前體物質(zhì)，ABA可以調(diào)節(jié)植物對于非生物逆境的適應(yīng)能力。很多研究表明，在煙草中過表達黃龍膽（Gentiana Lutea）和筆花豆（Stylosanthes guianensis）的NCED可以延長種子萌發(fā)時間、在一定程度上降低氣孔導度和蒸騰速率、提高內(nèi)源ABA的含量、增加對強光和氧化脅迫的抗性進而提高煙草的耐旱和耐鹽能力，但是轉(zhuǎn)化不同外源NCED基因作用各異[43-44]。 除此之外，類胡蘿卜素基因工程在煙草抗除草劑方面也有相關(guān)報道。Misawa等將細菌八氫番茄紅素基因crtl正義導入煙草，β-胡蘿卜素合成增強，同時對除草劑的抗性增強[45]。Wagner等將細菌八氫番茄紅素脫氫酶基因PDS導入煙草，對除草劑nor flurazon和 fluridone的抗性分別增加了58倍和3倍[46]。這為從類胡蘿卜素代謝途徑的上下游進行基因工程操作改善植物的抗性提供了思路。

4 討論與展望

綜上所述，隨著越來越多類胡蘿卜素代謝途徑中的主要基因和酶的分離和鑒定，利用基因工程手段提高類胡蘿卜素在細胞中的生產(chǎn)率、調(diào)整類胡蘿卜素的成分、改變生產(chǎn)類胡蘿卜素的宿主等，都將逐步變成現(xiàn)實。將水仙的類胡蘿卜素代謝基因PSY、LYCB和細菌的CrtI基因轉(zhuǎn)入水稻胚乳，育成胚乳中積累了大量類胡蘿卜素、米粒金黃的“黃金大米”[47]以及將歐氏桿菌CrtB轉(zhuǎn)入油菜，育成油菜種子中類胡蘿卜素含量比野生型增加了50倍，且主要為α-和β-胡蘿卜素的“金色油菜”[48]的成功案例為開展煙草類胡蘿卜素基因工程提供了有益思路。目前，類胡蘿卜素的基因工程改良以提高β-胡蘿卜素含量為主，隨著人們對玉米黃質(zhì)、蝦青素等其它類胡蘿卜素的營養(yǎng)功能和經(jīng)濟價值方面的認識，煙草作為一種生物反應(yīng)器－葉綠體轉(zhuǎn)基因植物[49-51]，必將在以后發(fā)揮其優(yōu)勢。

然而，相對于其它很多植物，目前對煙草類胡蘿卜素代謝的調(diào)控機制以及代謝關(guān)鍵基因的表達調(diào)控了解有限，利用基因工程來調(diào)控其代謝帶有一定的盲目性。而且通過基因工程改變類胡蘿卜素代謝途徑有可能會干擾其它萜類化合物如植物激素等的合成，引起代謝紊亂，從而影響植株的正常生長。類胡蘿卜素是復雜的光合系統(tǒng)的重要組分，因此在今后的類胡蘿卜素基因工程中要注意類胡蘿卜素代謝中源和庫的協(xié)調(diào)，對煙草香氣、品質(zhì)改良中應(yīng)保持與其它來源致香成分的協(xié)調(diào)，才能最終利于煙草品質(zhì)的提升。

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