張志博 ，李安文，李勤 ，肖文軍，3，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院植物資源工程系，湖南長沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院茶學(xué)系，湖南長沙410128）

越橘，果實為藍(lán)色或紅色漿果，杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生落葉或常綠灌木[1]。越橘花色苷作為天然植物色素，具有良好的生物活性以及抗氧化、抗炎抗癌、降血脂、保護(hù)視力的生理功能[2-9]，在臨床藥用以及保健食品開發(fā)方面均具有廣泛的應(yīng)用前景[10]。但是，由于越橘花色苷特殊的C6-C3-C6碳骨架特征結(jié)構(gòu)使其穩(wěn)定性較差[11]，限制了越橘花色苷在加工和貯藏過程中的應(yīng)用范圍。目前對于越橘花色苷的研究多集中于提取檢測、分離純化及藥理作用等方面[12-13]，而對其穩(wěn)定性缺少系統(tǒng)的研究[14-18]。本文以越橘濃縮汁為原料，通過單因素試驗和正交試驗系統(tǒng)考察了不同pH 條件、溫度、時間、離子種類和氧化劑等因子對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響，以期為越橘花色苷加工和貯藏提供一定的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 試驗原料

越橘濃縮果汁：黑龍江尚志綠野漿果有限公司，百粒糖度（65±2）°，花色苷含量3.25 mg/g。

1.1.2 儀器與試劑

Lab Tech 可見-紫外分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；EASY pureⅡ純水儀、SK3300LH 超聲波清洗器：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市金城國勝實驗儀器廠；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；pH 計、FA2104S 電子分析天平：上海精科天平廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：鞏義市英峪儀器廠；氯化鈉、二氯化錫、氯化銅、氯化鐵、氯化鉀、濃鹽酸、乙酸鈉、乙酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：上海永恒生物科技有限公司，純度98.5%。

1.2 方法

1.2.1 越橘花色苷含量檢測

取越橘濃縮果汁稀釋到一定濃度，全波長掃描，確定最大吸收波長。采用pH 示差法[19]以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣對越橘花色苷的吸光度值進(jìn)行檢測，根據(jù)其吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線算得其含量。

1.2.2 加標(biāo)回收率實驗

取越橘濃縮果汁稀釋加入相同量的標(biāo)準(zhǔn)品，在520 nm 和700 nm 下檢測吸光度值，計算越橘花色苷含量。

1.2.3 pH 對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液將越橘濃縮汁配制成pH 分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的溶液，室溫放置3 h，取樣檢測其吸光度，計算越橘花色苷含量。

1.2.4 溫度對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

將越橘花色苷濃縮汁稀釋到相同濃度，分別于4、25、40 ℃條件下放置4.0 h，測定其吸光度，計算越橘花色苷含量。

1.2.5 時間對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

將越橘花色苷濃縮汁稀釋到相同濃度，室溫下放置7 h，每隔1 h 取樣測定其吸光度，計算越橘花色苷含量。

1.2.6 不同離子對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

將越橘花色苷濃縮汁稀釋到相同濃度，分別加入KCl、FeCl3、CuCl2、FeCl2、SnCl2溶液，室溫下放置1 h 測定其吸光度，計算越橘花色苷含量。

1.2.7 不同氧化劑對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

將越橘花色苷濃縮汁稀釋到相同濃度，分別加入H2O2、FeCl3、CuCl2溶液，室溫放置2.0 h，每隔0.5 h 取樣測定其吸光度，計算越橘花色苷含量。

1.2.8 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取pH、溫度、時間3個對越橘花色苷穩(wěn)定性影響較大的因素，以花色苷的含量為指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗，考察越橘花色苷的穩(wěn)定性，正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表L9（33）Table1 Factors and levels in the orthogonal array experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 越橘花色苷檢測波長的確定

2.1.1 最大吸收波長的確定

由圖1 可知越橘花色苷在波長為440 nm～680 nm之間有一最大吸收峰（圖上的1 所標(biāo)注位置）值為520 nm。因此選取λ=520 nm 作為檢測波長進(jìn)行檢測。

圖1 越橘花色苷的全波長吸收圖譜Fig.1 The absorb curve of the anthocyanin of lingonberry at a whole wavelength

2.1.2 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果

選擇3 個不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度，得最終的回收率分別為96.0 %，98.1 %和101.3 %，說明在pH=1.0，λ=520 nm 波長條件下0.295～0.870 7 吸光度值在范圍內(nèi)，對越橘花色苷含量測定準(zhǔn)確有效。

2.2 越橘花色苷穩(wěn)定性的研究

2.2.1 pH 對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

pH 對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響見圖2。

圖2 pH 對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of the different pH conditions on the stability of lingonberry anthocyanins

由圖2 可知，在pH1.0～pH3.0 之間時，越橘花色苷的含量相對穩(wěn)定，且在pH=3.0 時含量最高，達(dá)0.257 mg。隨著pH 的逐漸加大，越橘花色苷含量逐漸降低，說明越橘花色苷在pH=3.0 時穩(wěn)定性較高。

2.2.2 溫度對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

溫度對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響見圖3。

圖3 溫度對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of different temperatures on the stability of lingonberry anthocyanins

由圖3 可知，越橘花色苷的含量隨溫度的增加呈明顯的下降趨勢，說明溫度越低越橘花色苷穩(wěn)定性越好。

2.2.3 時間對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

時間對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響見圖4。

圖4 時間對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of different storing time on the stability of lingonberry anthocyanins

由圖4 可知，隨著放置時間的增加，越橘花色苷的含量總體呈下降趨勢，放置時間越長其穩(wěn)定性就越差；可能是由于其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的緣故，也可能是在放置過程中受到光照等其他因素的影響而使含量發(fā)生變化。

2.2.4 不同離子對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

不同離子對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響見圖5。

圖5 不同離子對花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of different ions on the stability of lingonberry anthocyanins

從圖5 可以看出，不同金屬離子對越橘花色苷的穩(wěn)定性均有不同程度的影響。其中K+、Fe2+、Sn2+對越橘花色苷有一定的保護(hù)作用，而Fe3+、Cu2+對花色苷的穩(wěn)定性影響較大，花色苷損失較多，可能是越橘花色苷中的酚羥基結(jié)構(gòu)與Fe3+、Cu2+發(fā)生反應(yīng)生成沉淀，使其穩(wěn)定性降低。

2.2.5 不同氧化劑對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響

不同氧化劑對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響見表2。

表2 不同氧化劑對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of the different oxidants on the stability of lingonberry anthocyanins

從表2 可知，不同氧化劑對越橘花色苷穩(wěn)定性都有不同程度的影響，而H2O2和FeCl3在同一濃度下比CuCl2對越橘花色苷的影響要明顯，而且各種氧化劑對越橘花色苷的破壞程度與濃度存在一定的關(guān)系，濃度越高，花色苷受破壞的程度越大，其的穩(wěn)定性就越低；在不同的時間段內(nèi)，氧化劑對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響也不同，前期H2O2作用更為明顯，后期FeCl3、CuCl2較為明顯。氧化劑H2O2前期對花色苷的穩(wěn)定性影響更為明顯，可能是由于過氧化氫容易分解，隨著時間延長其分解程度加大，氧化性降低的緣故。

2.2.6 正交試驗

L9（33）正交試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 L9（33）正交試驗結(jié)果Table 3 Results of the optimizing examination

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of the analysis of variance

從表3 可看出，在pH1.0～pH3.0 的范圍內(nèi)，溫度、pH、時間三因素對花色苷穩(wěn)定性的影響大小依次為：溫度＞pH＞時間。由表4 可知，在處理3 中越橘花色苷降解量最大，即在pH=1.0 溫度40 ℃時間5 h 條件下花色苷穩(wěn)定性最低；處理7 中花色苷的降解量最少，即當(dāng)溫度4 ℃、pH=3.0、時間5 h 時花色苷穩(wěn)定性最強。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗和正交試驗對越橘花色苷的穩(wěn)定性的影響因素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同的試驗條件處理對花色苷的穩(wěn)定性影響程度不同，在溫度4 ℃、pH=3.0、時間5 h 時花色苷穩(wěn)定性最好，這可能是花色苷貯藏的最佳條件。但由于實驗條件的限制，本研究并未涉及糖苷酶，多酚氧化酶等酶類以及輔色劑、糖及降解產(chǎn)物等對越橘花色苷穩(wěn)定性的影響。隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷深入，通過化學(xué)修飾等技術(shù)手段改變越橘花色苷的結(jié)構(gòu)或通過生物工程技術(shù)方法生產(chǎn)高穩(wěn)定性的細(xì)胞等方法來提高越橘花色苷的穩(wěn)定性可能是未來發(fā)展的一個方向。

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