焦勝敏 (廊坊衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，河北 廊坊 065001)

喉鱗癌患者術(shù)后組織中神經(jīng)纖毛蛋白1、2的表達(dá)及對血管生成的作用

焦勝敏 (廊坊衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，河北 廊坊 065001)

目的觀察喉鱗癌組織中神經(jīng)纖毛蛋白(NRP)1、2的表達(dá)特點，關(guān)注二者對腫瘤中CD34陽性的血管生成的作用。方法收集79例喉鱗癌標(biāo)本作為觀察組，收集53例正常喉黏膜組織作為對照組，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測二組中NRP1、NRP2和CD34的表達(dá)，分析其在不同臨床特征中的表達(dá)差別及相關(guān)性。結(jié)果喉鱗癌中NRP1、NRP2表達(dá)的陽性率和CD34標(biāo)記的微血管密度(MVD)明顯高于對照組，觀察組中NRP1、NRP2表達(dá)的陽性率和MVD與腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量及Ki67的表達(dá)密切相關(guān)，線性相關(guān)分析顯示NRP1和MVD、NRP2和MVD具有正相關(guān)性，生存分析顯示NRP1、NRP2和MVD與患者的預(yù)后相關(guān)。結(jié)論NRP1、NRP2和MVD高表達(dá)在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，NRP1、NRP2具有促進(jìn)CD34陽性的血管生成的作用，聯(lián)合檢測NRP1、NRP2和MVD可能與喉鱗癌的預(yù)后密切相關(guān)。

喉鱗癌;神經(jīng)纖毛蛋白(NRP)1;NRP2;CD34;免疫組織化學(xué)

喉鱗癌發(fā)生與發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果。腫瘤進(jìn)展過程由多種基因和蛋白調(diào)控。神經(jīng)纖毛蛋白(NRP)家族是Semaphorins成員的受體，其具有兩個重要成員，即 NRP1、NRP2，二者在惡性腫瘤中高表達(dá)，近年來研究顯示 NRP1和NRP2可能對腫瘤中的血管生成有重要的促進(jìn)作用〔1〕。CD34是血管新生的重要標(biāo)志物，對血管內(nèi)皮的標(biāo)記作用強〔2〕。本實驗探討喉鱗癌組織中NRP1和NRP2的表達(dá)特征，關(guān)注二者對CD34陽性的血管密度(MVD)的作用，探討其表達(dá)的臨床價值及對判斷預(yù)后的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 廊坊市人民醫(yī)院2005年1月至2006年7月存檔的喉鱗癌標(biāo)本的蠟塊79例作為觀察組，均符合WHO中關(guān)于喉鱗癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理科專家確診。年齡54～79(平均59.2)歲，腫瘤大小0.5～5.3 cm。同時選取同期病理證實為正常喉黏膜組織53例作為對照組。二組在一般臨床資料的比較中無明顯差別，具有可比性。

1.2 方法 NRP1、NRP2和CD34的濃縮液均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，實驗前均進(jìn)行預(yù)實驗，選擇最理想稀釋濃度用于正式實驗。免疫組化應(yīng)用SP法完成，嚴(yán)格質(zhì)量控制。具體步驟:脫蠟后置于自來水中進(jìn)行水化，3%H2O2去離子水孵育10 min后，行抗原修復(fù)，加入稀釋好的 NRP1、NRP2或CD34一抗蛋白，在室溫中孵育2 h，應(yīng)用 PBS進(jìn)行沖洗，5 min×3次;加入二抗，在室溫中孵育20 min，應(yīng)用PBS進(jìn)行沖洗，5 min×3次;加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，在室溫中孵育半小時，應(yīng)用PBS進(jìn)行沖洗，5 min×3次;加入DAB進(jìn)行顯色后自來水沖洗，按常規(guī)操作進(jìn)行封片。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) NRP1、NRP2蛋白的陽性細(xì)胞均位于細(xì)胞質(zhì)中，以染成棕黃或棕褐色為陽性，隨機觀察計數(shù)10個高倍視野的NRP1、NRP2蛋白的陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)的百分率，取其平均值，以平均每個高倍鏡視野的陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)≥25%為陽性，以 ＜25%為陰性，計算陽性率。MVD的判斷方法:確定CD34染色細(xì)胞叢作為一個血管，先在低倍鏡下全面觀察切片以確定腫瘤內(nèi)血管密度最高處。再在高倍鏡下，以與周圍腫瘤細(xì)胞和結(jié)締組織成分明顯區(qū)別的任何一個棕色染色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢為一個血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也作為一個血管計數(shù)。記錄5個視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗或t檢驗，并進(jìn)行線性相關(guān)性分析和生存分析。

2 結(jié)果

2.1 NRP1、NRP2和MVD在觀察組與對照組中的表達(dá) 由表1可見，觀察組與對照組中NRP1、NRP2表達(dá)的陽性率和CD34標(biāo)記的微血管密度差別顯著(P＜0.01)。

2.2 NRP1、NRP2和MVD在觀察組中不同臨床特征中的表達(dá)比較 觀察組中NRP1、NRP2和MVD與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn) 移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量及Ki67的表達(dá)密切相關(guān)。見表2。

表1 NRP1、NRP2陽性表達(dá)和MVD在觀察組與對照組中的表達(dá)

2.3 喉鱗癌組織中NRP1、NRP2和MVD表達(dá)的關(guān)系 對觀察組中NRP1、NRP2和MVD的表達(dá)進(jìn)行線性相關(guān)性分析，結(jié)果顯示 NRP1和 NRP2(r=0.45，P=0.022 1)、NRP1 和 MVD(r=0.43，P=0.014 2)、NRP2 和 MVD(r=0.43，P=0.035 9)均呈正相關(guān)性。

2.4 喉鱗癌組織中NRP1、NRP2和MVD的表達(dá)與生存的關(guān)系隨訪時間7～60(平均37.5)個月。經(jīng)生存分析顯示，NRP1(χ2=6.15，P=0.022 4)、NRP2(χ2=8.35，P=0.017 6)和 MVD(χ2=10.09，P=0.010 9)的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，即 NRP1、NRP2 和MVD高表達(dá)患者的預(yù)后差。

3 討論

NRP1和NRP2常表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞，是神經(jīng)生長因子抑制因子Sema 3A和血管內(nèi)皮生長因子165的受體，因此NRP1和NRP2對神經(jīng)軸突的生長及血管的生成有重要促進(jìn)作用。NRP1和NRP2是潛在血管生成因子，其在腫瘤細(xì)胞惡變及血管化中高表達(dá)，尤其是當(dāng)NRP1和NRP2高表達(dá)時常伴隨著血管內(nèi)皮生長因子的高表達(dá)。有研究通過體內(nèi)誘導(dǎo)AT2.1細(xì)胞表達(dá)NRP1時，可以引起腫瘤體積的增加，腫瘤部位新生毛細(xì)血管密度增加〔3〕，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管擴張，此時腫瘤的凋亡指數(shù)下降〔4〕。因此NRP1和NRP2可能類似癌基因的作用，也可能通過VEGF的過表達(dá)引起腫瘤的血管增生，使腫瘤增大，加速腫瘤的進(jìn)展。血管生成是當(dāng)今人們關(guān)注的重要生物學(xué)行為，其調(diào)節(jié)蛋白關(guān)系復(fù)雜，通路作用多〔5〕。CD34是現(xiàn)今被人們認(rèn)為標(biāo)記血管生成的最好標(biāo)記物，在血管新生方面明顯優(yōu)于Ⅷ因子等血管標(biāo)記物〔6〕。腫瘤分泌多種成血管信號時，腫瘤血管可以由周圍正常組織的固有血管向腫瘤組織內(nèi)容延伸而成，也可以通過內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞分化后形成內(nèi)皮依賴性血管。NRP1、NRP2與腫瘤的血管生成可能具有內(nèi)在關(guān)系，并已引起學(xué)者們的關(guān)注。

本研究結(jié)果提示NRP1、NRP2和血管密度在腫瘤進(jìn)展中具有重要作用;且NRP1、NRP2可能參與腫瘤的進(jìn)展及淋巴道轉(zhuǎn)移。由于以上因素均與預(yù)后相關(guān)，因此聯(lián)合檢測NRP1、NRP2和MVD表達(dá)可能與預(yù)后相關(guān)，生存分析結(jié)果證實了此結(jié)論，即NRP1、NRP2和MVD高表達(dá)喉鱗癌患者的預(yù)后差。線性相關(guān)分析結(jié)果顯示NRP1、NRP2和MVD具有協(xié)同正向作用，提示三者具有正向協(xié)同作用，NRP1、NRP2可能作為上游蛋白，具有直接調(diào)節(jié)CD34陽性的血管生成，其次NRP1、NRP2之間的作用也可能通過VEGF聯(lián)系起來，通過脈管的激活與脈管的生成而發(fā)揮協(xié)同作用，因此NRP1和 CD34標(biāo)記的MVD，NRP2和CD34標(biāo)記的MVD均可能具有通路作用。而且NRP1、NRP2還可能參與鱗癌相關(guān)蛋白的增殖反應(yīng)，或激活其他癌基因和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，共同促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。

1 張 佳，張速勤，董 頻，等.喉鱗癌組織中NRP-1、VEGF的表達(dá)變化及意義〔J〕.山東醫(yī)藥，2012;50(18):95-6.

2 張更琳，孔維佳.Neuropilin-1在喉癌組織及喉癌細(xì)胞系中的表達(dá)〔J〕.臨床耳鼻咽喉科雜志，2006;20(14):634-5.

3 陳 潔，張紅闖，宋曉萌，等.NRP1、NRP2及SEMA 3F在口腔癌組織及TCa、ACC細(xì)胞系中的表達(dá)及其可能的作用〔J〕.口腔醫(yī)學(xué)，2009;29(5):235-7.

4 慶琳琳，李建生，師曉天.Neuropilin1在食管鱗癌中的表達(dá)及其意義〔J〕.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2005;14(4):386-8.

5 劉愛東，龐久玲，劉士生.胃癌中基質(zhì)金屬蛋白酶-9和CD105表達(dá)關(guān)系的研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009;29(7):886-7.

6 Yang P，Yuan W，He J.Overexpression of EphA2，MMP-9，and MVDCD34 in hepatocellular carcinoma:Implications for tumor progression and prognosis〔J〕.Hepatol Res，2009;39(12):1169-77.

R739.65

A

1005-9202(2013)05-1037-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.022

焦勝敏(1972-)，女，碩士，高級講師，副主任中醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療眼疾病研究。

〔2012-05-21收稿 2012-09-10修回〕

(編輯 張海彬)