谷曉蕾， 田亞平

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

氨 基 甲 酸 乙 酯 （Ethyl Carbamate， 又 叫Urethane），是一種具有遺傳毒性及致癌性的物質(zhì)[1-5]，存在于許多發(fā)酵食品（如醬油、酵母、奶酪等）和酒精飲料（如黃酒、白酒、葡萄酒等）中[6-12]。隨著人民生活水平的不斷提高，天然發(fā)酵食品中微量成分的合理控制和食品品質(zhì)的不斷提升已日益受到國內(nèi)外食品行業(yè)的關(guān)注。研究表明，去除成品黃酒中已產(chǎn)生EC的主要途徑之一為酶解法[13]。

目前，國內(nèi)主要是對氨基甲酸乙酯檢測方法的研究，而對氨基甲酸乙酯降解酶的研究報道較少。國外則早在20世紀(jì)60年代，就有報道說小鼠能降解被14C標(biāo)記的氨基甲酸乙酯，之后，Yamamoto等人在小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)了降解氨基甲酸乙酯的能力，因?yàn)樽饔媚芰艿停?，他們并不能確認(rèn)這是酶促反應(yīng)所致。近來，國外報道的來自小鼠糞便的檸檬酸桿菌（Kyoichi Kobashi等人，1990 年）[4]、小鼠腸胃的地衣芽孢桿菌 （Zhao Chun Ju等人，1991年）[5]和B.R.Mohapatra篩選自海洋微生物的球狀細(xì)菌所產(chǎn)的氨基甲酸乙酯降解酶在酸性和中性條件下都具有一定的酶活。

本課題組前期篩選和鑒定出一種P.variabile JN-A525菌株具有產(chǎn)EC降解酶的能力，粗酶特性研究和初步應(yīng)用效果發(fā)現(xiàn)，其最適pH在酸性范圍，有一定耐乙醇能力，在復(fù)雜的實(shí)際黃酒體系中仍然有水解氨基甲酸乙酯的能力，具備一定的應(yīng)用潛力。為提高該菌產(chǎn)酶能力，作者對P.variabile JNA525的生長及其產(chǎn)酶的適宜條件進(jìn)行研究，并對所產(chǎn)氨基甲酸乙酯降解酶初步純化，進(jìn)一步考察該酶在模擬黃酒體系中所表現(xiàn)的底物特異性，為酶解法控制黃酒微量成分的實(shí)際應(yīng)用建立了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 P.variabile JN-A525是作者所在實(shí)驗(yàn)

室篩選獲得的產(chǎn)氨基甲酸乙酯降解酶的菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）種子培養(yǎng)基:蛋白胨 1 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO42 g/L，pH 5.5。

2）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，pH 6.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備 用適量的無菌水洗下瓊脂斜面上新鮮、生長旺盛的孢子，然后移入裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，置于恒溫調(diào)速搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為230 r/min，溫度為30℃，培養(yǎng)6 h。

1.2.2 酶活的測定方法 根據(jù)Berthelot反應(yīng)[14-15]，用比色法625nm測定酶活力。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定 采用Forlin酚法[16]測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化 以P.variabile JN-A525生長狀況、產(chǎn)酶活力為指標(biāo)，優(yōu)化培養(yǎng)基碳源、氮源、初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量等。并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對接種量、裝液量、起始pH和發(fā)酵溫度進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)。

1.2.5 酶的初步純化流程 酶的初步純化流程見圖1。

圖1 酶的初步純化流程圖Fig.1 Workflow of preliminary purification of urethanase

1.2.6 初步純化酶的底物特異性 在15%酒精含量、pH 4.4的條件下，分別以3%甘氨酸、3%谷氨酸、3%氨基甲酸甲酯、3%氨基甲酸乙酯、3%γ-氨基丁酸、3%芐酯、3%苯胺酰胺、3%尿素、3%氨基丁酸、3%丁酯、3%谷氨酰胺為底物，各取1 mL于標(biāo)記好的比色管中，分別加入1 mL酶液，50℃水浴反應(yīng)30 min，測定 OD625值。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)

前期對碳源、氮源、溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量、pH值、無機(jī)鹽離子等單因素進(jìn)行考察，在此基礎(chǔ)上，采用四因素三水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，不考慮因素間的相互作用，因素設(shè)計(jì)見表1，研究結(jié)果見表2。

表1 四因素三水平正交設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal experiment

由極差分析可以看出，各因素影響酶活力順序?yàn)?C＞A＞B＞D，即發(fā)酵溫度是影響EC降解酶酶活力的主要因素，其次是裝液量，然后是接種量和發(fā)酵pH值。產(chǎn)EC降解酶最適條件組合為:A2B2C3D1，即250 mL的三角瓶裝液量70 mL，接種體積分?jǐn)?shù)3%，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵初始pH 6。

將正交試驗(yàn)所得的最佳組合A2B2C3D1。做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測定酶活力平均值為522.1 U/L，與初始單因素優(yōu)化前的150 U/L相比，酶活水平提高了3.47倍。1997年，B.R.Mohapatra和M.Bapuji篩選自海洋微生物的球狀細(xì)菌所產(chǎn)的氨基甲酸乙酯降解酶酶活為0.897 IU/mL[13]。上述搖瓶的優(yōu)化條件為后期進(jìn)一步的發(fā)酵放大研究創(chuàng)造了良好的基礎(chǔ)。

2.2 酶的初步純化

前期考察表明該真菌所產(chǎn)的能降解氨基甲酸乙酯的酶是一種胞內(nèi)酶，收集菌體破碎細(xì)胞后對粗酶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其最適溫度為50℃，最適pH 6.0，具一定的乙醇耐受性（黃酒的酒精度15%時，相對酶活仍能達(dá)65%左右），模擬黃酒體系 （乙醇15%，EC 3%，pH 4.4）中對氨基甲酸乙酯（EC）有相對較強(qiáng)的水解能力，對氨基甲酸甲酯（MC）也有一定作用。

在上述基礎(chǔ)上，為排除雜質(zhì)干擾，相對準(zhǔn)確地了解氨基甲酸乙酯降解酶的特性，采用超聲破碎、鹽析、Superdex G-75凝膠過濾層析基本步驟進(jìn)行初步純化，純化結(jié)果見表3。

表3 變幻青霉氨基甲酸乙酯降解酶的初步純化結(jié)果Table 3 Resultsofthe preliminary purification of urethanase from Penicillium variabile JN-A525

真菌發(fā)酵后的體系往往非常復(fù)雜，純化過程中跟蹤分析氨基甲酸乙酯降解酶的活性，過程中需要特別注意氨離子的干擾，鹽析過程選擇了硫酸鈉在夏天30℃以上的室溫進(jìn)行，表3結(jié)果表明，純化過程中該酶比活已獲得逐步提高，幅度不大的原因可能與該酶低濃度時的穩(wěn)定性欠佳有一定關(guān)系，所以后期可進(jìn)一步采用傳統(tǒng)誘變育種和分子生物學(xué)手段來提升產(chǎn)酶水平和所產(chǎn)酶的穩(wěn)定性。

2.3 模擬黃酒體系下酶底物特異性驗(yàn)證

超聲破碎后的粗酶液已進(jìn)行過一些酶學(xué)基本特性的研究，為排除干擾，對經(jīng)過上面步驟純化后的酶在模擬黃酒體系下進(jìn)行底物特異性方面的驗(yàn)證。圖2結(jié)果表明:Penicillium variabile JN-A525菌株所產(chǎn)EC分解酶對氨基甲酸乙酯、尿素、苯甲酰胺有相對較強(qiáng)的降解能力，對氨基甲酸甲酯也可以作用，但作用較弱，對一些氨基酸基本沒表現(xiàn)作用。因尿素是生成氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)，因此該酶可通過作用于尿素，減少其進(jìn)一步與乙醇生成氨基甲酸乙酯的可能，亦可直接作用于氨基甲酸乙酯，降低黃酒中氨基甲酸乙酯的含量。

圖2 變幻青霉所產(chǎn)EC降解酶的底物特異性Fig.2 Substrate specificity of urethanase from Penicillium variabile JN-A525

3 結(jié)語

作者在單因素研究基礎(chǔ)上運(yùn)用正交研究變幻青霉Penicillium variabile JN-A525產(chǎn)氨基甲酸乙酯降解酶的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，使得酶活提高了3.47倍，為后期大規(guī)模發(fā)酵調(diào)控的研究建立了一定的基礎(chǔ)。

對初步純化后的氨基甲酸乙酯降解酶在模擬黃酒體系下的底物特異性的研究，說明了該酶不但可通過作用于尿素，減少其進(jìn)一步與乙醇生成氨基甲酸乙酯的可能，亦可直接作用于氨基甲酸乙酯，降低黃酒中氨基甲酸乙酯的含量，說明該酶有在黃酒一些微量成分的控制中發(fā)揮作用的潛力。

真菌產(chǎn)生的酶系往往非常豐富和復(fù)雜，還有周期較長的缺陷，因此課題組將在充分考察其所產(chǎn)酶的特性基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用分辯率較高手段純化該酶，獲得其蛋白質(zhì)序列，可為其后期的異源高效表達(dá)創(chuàng)造良好條件。

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