鄒飛雁， 白 順， 白衛(wèi)濱， 孫建霞， 張 磊， 黃亞?wèn)|， 孫偉偉

（1.暨南大學(xué) 發(fā)育與再生生物學(xué)系，廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；

3.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州510090；4.暨南大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，廣東廣州510632）

食品在加工貯藏過(guò)程中易受到氯丙醇污染。添加不合衛(wèi)生條件的酸水解蛋白質(zhì)液，容易引起醬油、蠔油等調(diào)味品含有氯丙醇[1]。近幾年在飲用水、發(fā)酵香腸、餅干、面包、燒煮魚(yú)、肉制品及膨化食品中檢出氯丙醇化合物[2]。此外，家庭烹飪熱加工也會(huì)導(dǎo)致食物中氯丙醇的產(chǎn)生，危害人體健康。氯丙醇污染及殘留已成為一個(gè)國(guó)際性食品安全問(wèn)題，引起人們廣泛關(guān)注[3]。氯丙醇主要有3-氯1，2-丙二醇、1，3-二氯-2-丙醇、2，4-二氯-1-丙醇、2-氯-1，3-丙二醇等幾種同系物，其中3-氯1，2-丙二醇 （3-Monochloropropane-1，2-diol，3-MCPD）是最常見(jiàn)的氯丙醇類(lèi)污染物之一。研究表明，氯丙醇具有一定的毒性作用，特別是3-MCPD，具有致癌性[4-5]。Sunahara[6]等人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期對(duì)大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，喂食含3-MCPD的食物可能增加睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌的發(fā)病率，其具體的毒性機(jī)理目前還不明確，特別是體外的還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)3-MCPD對(duì)體外培養(yǎng)R2C細(xì)胞的毒性損傷情況，探討氯丙醇引起雄性生殖毒性的機(jī)制，為氯丙醇的食品安全評(píng)價(jià)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 R2C細(xì)胞（大鼠睪丸間質(zhì)瘤細(xì)胞株）:由暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心提供；3-MCPD:上海晶純公司；F12培養(yǎng)液、胰酶、胎牛血清、馬血清、肌氨酸鈉:美國(guó)Sigma公司；MTT、DMSO:美國(guó) Amresco 公司；EDTANa2、Triton-X100、Tris:美國(guó)Genview公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖:美國(guó)FMC公司；正常熔點(diǎn)瓊脂糖:西班牙Biowest公司；孕酮放免試劑盒:北京北方生物技術(shù)研究所。

1.1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀:美國(guó)Thermo公司；GC-1200γ放射免疫計(jì)數(shù)儀:安徽中科中佳公司；DDL-5低溫離心機(jī):上海安亭公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT檢測(cè)3-MCPD對(duì)R2C細(xì)胞增殖的影響R2C細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL，96孔板內(nèi)每孔接種200 μL細(xì)胞懸液。24 h后加入用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋的3-MCPD溶液，使每孔終濃度分別為 0.5、1、2、4、6 mmol/L。 設(shè)有空白組 （無(wú)細(xì)胞）和對(duì)照組（無(wú)藥物），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。藥物作用48 h 后，加入 20 μL、5 mg/mL 的 MTT。 作用 4 h 后吸去孔內(nèi)液體，每孔加200 μL DMSO溶解沉淀，放于脫色搖床搖勻10 min后于酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的吸光值[7]。通過(guò)以下公式及SPSS軟件分析3-MCPD 刺激細(xì)胞 48 h 后的 IC25、IC50、IC75。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=[1-（給藥組吸光度-空白組吸光度）/（對(duì)照組吸光度-空白組吸光度）]×100%

1.2.2 單細(xì)胞電泳檢測(cè)3-MCPD對(duì)R2C細(xì)胞DNA損傷情況 調(diào)整對(duì)數(shù)期R2C細(xì)胞懸液的濃度為1×105個(gè)/mL，以每孔1 mL的細(xì)胞懸液接種到6孔板內(nèi)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h加入3-MCPD，使其終濃度為IC25、IC50和IC75。培養(yǎng)4 h后收獲細(xì)胞，4℃冷卻。

取0.8 g/dL正常熔點(diǎn)瓊脂糖，加熱熔化后，冷卻至45℃，取100 μL滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，4℃、10 min 后取下蓋玻片。104個(gè)細(xì)胞與 75 μL、0.8 g/dL的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液在37℃下混勻，迅速滴在第一層瓊脂糖上，加上蓋玻片，4℃、10 min后取蓋玻片。玻片浸入預(yù)冷的裂解液 （2.5mol/LNaCl，100mmol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris，1%Triton X 100 及 10%DMSO組成，臨用前配用，pH 10），4℃保持1 h。 取玻片，蒸餾水洗3次后，放入電泳槽，加電泳液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 13），電泳液面需高出玻片0.25 cm，靜置20 min后于25 V、200 mA電泳15～20 min。取玻片置于 0.4 mol/L Tris（pH 7.5）溶液中洗滌 3次，每次10 min。避光滴加20 μL、25 μg/mL EB 染色， 蓋上蓋玻片后熒光顯微鏡下觀察拍照。CASP軟件分析電泳結(jié)果。

1.2.3 放射免疫法檢測(cè)3-MCPD對(duì)R2C細(xì)胞合成孕酮的影響 對(duì)數(shù)期R2C細(xì)胞懸液以1×106/mL的密度接種到6孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h后，換上分別含IC25、IC50和IC75濃度3-MCPD的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h或24 h后提取上清液，400 g離心5 min，-20℃保存。用放射免疫試劑盒檢測(cè)上清液中的孕酮含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS軟件19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析結(jié)果，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3-MCPD對(duì)R2C細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

不同濃度的3-MCPD作用R2C細(xì)胞48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。由圖1可見(jiàn)，隨著濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均發(fā)生了變化。細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓，且貼壁不穩(wěn)定，隨著濃度的增加，此現(xiàn)象越明顯，同時(shí)細(xì)胞抑制率隨著3-MCPD濃度的增大也逐漸增大，見(jiàn)表1。通過(guò)SPSS軟件分析得出3-MCPD 對(duì) R2C 細(xì) 胞 的 IC25、IC50、IC75分 別 為1.027、1.802、3.160 mmol/L。

圖1 不同濃度3-MCPD刺激R2C細(xì)胞48 h后的細(xì)胞形態(tài)圖（200×）Fig.1 Morphology ofR2C cells under different concentration of 3-MCPD for 48 h

表1 不同濃度3-MCPD對(duì)R2C細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響Table 1 Inhibitory effect of 3-MCPD on R2C cells

2.2 3-MCPD對(duì)R2C細(xì)胞DNA損傷的作用

不同濃度3-MCPD刺激R2C細(xì)胞4 h后，細(xì)胞拖尾的長(zhǎng)度隨著濃度的增加而增長(zhǎng)，見(jiàn)圖2。通過(guò)CASP軟件分析尾部DNA%、尾長(zhǎng)、尾距以及Olive尾距等數(shù)據(jù)得出，見(jiàn)圖3。IC75濃度組對(duì)細(xì)胞DNA有明顯的損傷作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其他組與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性的變化。

圖2 不同濃度3-MCPD刺激4 h后對(duì)R2C細(xì)胞DNA損傷作用Fig.2 Damage of DNAs in R2C cells after treatment with 3-MCPD

圖3 不同濃度3-MCPD刺激4 h后對(duì)R2C細(xì)胞尾部DNA%、尾長(zhǎng)、Olive尾距的影響Fig.3 Effect of 3-MCPD on head DNA （%），tail length and olive tail moment in R2C cells

2.3 3-MCPD對(duì)R2C細(xì)胞分泌孕酮的影響

RIA結(jié)果顯示，不同濃度3-MCPD作用R2C細(xì)胞4 h后，IC75組能夠明顯影響細(xì)胞孕酮的合成，其他各濃度組與對(duì)照組相比對(duì)孕酮合成沒(méi)有顯著影響，見(jiàn)圖4。而在作用24 h后，可見(jiàn)孕酮合成量顯著降低，且隨著濃度的增加，降低也更明顯，見(jiàn)圖5。

圖4 不同濃度3-MCPD刺激4 h后對(duì)R2C細(xì)胞孕酮合成的影響Fig.4 Effects of 3-MCPD on progesterone production of R2C cells for 4 h

圖5 不同濃度3-MCPD刺激24 h后對(duì)R2C細(xì)胞孕酮合成的影響Fig.5 Effects of 3-MCPD on progesterone production of R2C cells for 24 h

3 結(jié)語(yǔ)

生殖系統(tǒng)是氯丙醇主要的靶器官[8]，其中睪丸又是雄性生殖系統(tǒng)最主要的生殖腺。睪丸最主要的一個(gè)功能即睪丸間質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生雄激素睪酮，睪酮對(duì)維持正常的雄性生理功能起到至關(guān)重要的作用。

本研究首先發(fā)現(xiàn)了R2C細(xì)胞在3-MCPD的刺激下生長(zhǎng)明顯受抑制，3-MCPD濃度在0～6 mmol/L范圍內(nèi)，其抑制細(xì)胞增殖的作用為5.99%～96.87%，表明了3-MCPD可能是通過(guò)抑制R2C細(xì)胞的增殖來(lái)影響生殖系統(tǒng)的正常運(yùn)行。體外實(shí)驗(yàn)表明，3-MCPD及其代謝物縮水甘油對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞具有明顯的DNA損傷作用[9]。本研究的SCGE結(jié)果顯示， 濃度為 1.027、1.802、3.160 mmol/L 的 3-MCPD刺激R2C細(xì)胞4 h后，其中3.160 mmol/L刺激組，其尾部DNA%、尾長(zhǎng)和Olive尾距分別增加342.6%、137.4%和409.7%，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而其余兩組與對(duì)照組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果顯示，3-MCPD對(duì)R2C細(xì)胞也具有一定程度的DNA損傷作用。孕酮是睪酮合成的第一步，通過(guò)檢測(cè)孕酮水平可間接說(shuō)明睪酮的分泌量[10]。RIA的結(jié)果顯示，濃度為1.027、1.802、3.160 mmol/L的3-MCPD刺激R2C細(xì)胞4 h后，其中有3.160 mmol/L刺激組合成的孕酮與對(duì)照組相比降低了16.0%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3-MCPD繼續(xù)作用細(xì)胞24 h后，各濃度組孕酮合成量與對(duì)照組相比分別降低9.5%、20.6%及61.2%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

總之，3-MCPD對(duì)體外培養(yǎng)的R2C具有明顯抑制增殖和DNA損傷作用，并降低R2C細(xì)胞合成的孕酮，進(jìn)而影響睪酮合成。通過(guò)以上結(jié)果推測(cè)，3-MCPD可通過(guò)影響R2C細(xì)胞孕酮合成過(guò)程相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)孕酮合成。但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為3-MCPD屬于非遺傳毒性致癌物，在體內(nèi)小鼠骨髓微核和大鼠肝非程序性DNA合成試驗(yàn)中，結(jié)果均為陰性[11]。目前對(duì)于體外試驗(yàn)中3-MCPD具有遺傳毒性的解釋有兩種:一種認(rèn)為3-MCPD在大鼠體內(nèi)的主要代謝物為β-氯代乳酸，并沒(méi)有產(chǎn)生縮水甘油等其他具遺傳毒性的代謝物[4]；另一種認(rèn)為3-MCPD能與體外的培養(yǎng)基中某些化合物反應(yīng)，產(chǎn)物具有遺傳毒性作用[12]，其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究討論。

[1]張燁，丁曉雯.食品中氯丙醇污染及其毒性[J].糧食與油脂，2005，7:44-46.ZHANG Ye，DING Xiao-wen.Contaminant and toxicity of chloropropanol in food[J].Cereals and Oils，2005，7:44-46. （in Chinese）

[2]王衛(wèi)華，徐銳鋒，劉軍，等.食品中氯丙醇測(cè)定方法研究進(jìn)展[J].化學(xué)分析計(jì)量，2007，16（3）:74-76.WANG Wei-hua，XU Rui-feng，LIU Jun，et al.Progress in determination method of chloropropanols in food[J].Chemical Analysis and Meterage，2007，16（3）:74-76.（in Chinese）

[3]傅武勝，李敬光，張珙，等.我國(guó)市售醬油氯丙醇污染研究:地區(qū)間污染水平的比較[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（2）:92-96.FU Wu-sheng，LI Jing-guang，ZHANG Hong，et al.Occurrence of chloropropanols in soy sauce in retailer in China:comparison of the levels of chloropropanols of soy sauce from the various origins[J].Food and Fermentation Industries，2007，33（2）:92-96.（in Chinese）

[4]HWANG Myungsil，YOON Eunkyung，KIM Jayoung，et al.Toxicity value for 3-monochloropropane-1，2-diol using a benchmark dose methodology[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology，2009，53（2）:102-106.

[5]CHO W S，HAN B S，KIM C，et al.Carcinogenicity study of 3-monochloropropane-1，2-diol in sprague-dawley rats[J].Food Chem Toxicol，2008，46:3172-3177.

[6]Jones A R，Milton D H，Murcott C.The oxdative metabolism of alpha-chlorohydrin in the male rat and the formation of spermatoceles[J].Xenobiotica，1978，8:573.

[7]陳義勇，顧小紅，湯堅(jiān).樺褐孔菌多糖的抗腫瘤活性研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（1）:65-69.CHEN Yi-yong，GU Xiao-hong，TANG Jian.Study on anti-tumor activities of polysaccharides from Inonotus obliquus[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2011，30（1）:65-69.（in Chinese）

[8]李寧，劉澤欽，賈旭東，等.氯丙醇對(duì)大鼠的毒性研究[J].衛(wèi)生研究，2003，32（4）:349-352.LI Ning，LIU Ze-qin，JIA Xu-dong，et al.Study on the toxicological effect of chloropropanols on rats[J].Journal of Hygiene Research，2003，32（4）:349-352.（in Chinese）

[9]Ramy R E，Elhkim M O，Lezmi S，et al.Evaluation of the genotoxic potential of 3-monochloro-propane-1，2-diol（3-MCPD）and its metabolites，glycidol and beta-chlorolactic acid，using the single cell gel/comet assay[J].Food Chem Toxicol，2007，45:41-48.

[10]ZHANG Qi-hao，ZOU Ping，ZHAN Hai-chao，et al.Dihydrolipoamide dehydrogenase and cAMP are associated with cadmiummediated Leydig cell damage[J].Toxicology Letters，2011，205:183-189.

[11]Piasecki A，Ruge A，Marquardtm H.Maligant transformation of mouse M2 fibro-blasts by glycerol chlorohydrines contained in protein hydrolysates and commercial food[J].Arzaneimit-Telforschung，1990，40（9）:1054.