張 靜， 田亞平

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

氨肽酶是一類從蛋白質(zhì)或肽鏈的N端酶切氨基酸殘基的外肽酶的總稱[1]。氨肽酶的分布廣泛，主要存在于動(dòng)物組織和植物中，由于動(dòng)植物中的氨肽酶的含量比較低，提取成本高，所以利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶是近年來酶制劑行業(yè)的熱點(diǎn)和趨勢(shì)，產(chǎn)氨肽酶的微生物的種類繁多，例如細(xì)菌、霉菌、酵母等。

氨肽酶的應(yīng)用廣泛，可協(xié)助切掉肽鏈末端疏水性氨基酸，脫除蛋白水解物的苦味[2]；與不同的內(nèi)切酶復(fù)配，參與蛋白質(zhì)的深度水解[3]；制備多功能活性肽；還可以作為N端測(cè)序工具酶和醫(yī)療診斷用酶。

酶作為一種生物催化劑，因其半衰期短、易失活等缺點(diǎn)嚴(yán)重影響著酶的使用效果。氨肽酶作為一種工業(yè)化酶制劑，酶的熱穩(wěn)定性是一個(gè)很關(guān)鍵的因素。酶的熱穩(wěn)定性提高具有明顯的優(yōu)勢(shì)，延長(zhǎng)酶的儲(chǔ)存時(shí)間、減少在運(yùn)輸過程中的酶活損失，使酶在較高反應(yīng)溫度下延長(zhǎng)酶的反應(yīng)時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，有效的降低生產(chǎn)成本[4]。所以，如何提高酶的穩(wěn)定性，從而擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍的研究越來越引起人們的重視。

目前，提高酶穩(wěn)定性的策略主要從酶分子改造和微環(huán)境改良[5]兩方面入手。酶分子改造包括定點(diǎn)突變、化學(xué)修飾以及酶固定化等方法；微環(huán)境改良包括添加保護(hù)劑、防腐劑、蛋白酶抑制劑、抗氧化劑和還原劑等。其中化學(xué)修飾是提高和改善酶催化性能的有效方法之一。季波、徐瀅波等[6]采用氰脲酰氯法活化的聚乙二醇-6000對(duì)牛血Cu，Zn-SOD進(jìn)行化學(xué)修飾，制得的修飾酶比天然SOD在熱穩(wěn)定性、酸堿條件以及抗酶解三方面的穩(wěn)定性均有不同程度的提高。曹向宇、劉劍利等[7]利用右旋糖酐對(duì)玉米SOD進(jìn)行修飾，修飾后玉米SOD的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性均有顯著提高，半衰期延長(zhǎng)，對(duì)蛋白酶的耐受性增強(qiáng)。天然酶分子上的Lys殘基末端的ε-NH2由于具有較強(qiáng)的親核性，使得ε-NHε成為化學(xué)修飾的首選官能團(tuán)。Marta Kotorman、Andras Cseri、Ilona Laczko等[8]用乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐、鄰苯二甲酸酐等不同的酸酐修飾α-胰凝乳蛋白酶，提高了酶在不同有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性。

采用丁二酸酐對(duì)氨肽酶進(jìn)行化學(xué)修飾，通過紫外-可見吸收光譜和圓二色光譜表征修飾前后酶的結(jié)構(gòu)變化，并考察了修飾前后酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)、最適溫度、穩(wěn)定穩(wěn)定性、最適pH、pH穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis）Zj016，作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 主要試劑 L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺:美國(guó)Alfa 公司；氨肽酶:作者所在實(shí)驗(yàn)室制備；2，4，6-三硝基苯磺酸:上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；丁二酸酐:化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)試劑:自制；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 BCD-208K型低溫冰箱:青島海爾股份有限公司；722型分光光度計(jì):上海第三分析儀器廠；SHZ-22電熱恒溫水浴鍋:上海醫(yī)療器械五廠；Delta320 pH計(jì):電子天平AL204，梅特勒-托利多公司；MOS-450圓二色光譜儀:法國(guó)Biologic公司；UV-3000掃描型紫外-可見分光光度計(jì):日本HITACHI公司；透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000）:Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丁二酸酐對(duì)氨肽酶的化學(xué)修飾方法 參照文獻(xiàn)[9]方法并進(jìn)行優(yōu)化，稱取20 mg的氨肽酶粉溶解在15 mL、0.05 mol/L pH 8.5的 Tris-HCl緩沖液中，然后向混合液中緩慢加入10 mg的丁二酸酐，攪拌溶解，在整個(gè)反應(yīng)過程中用2 mol/L NaOH溶液維持反應(yīng)體系的pH值為8.0，在4℃條件下反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后，用 0.05 mol/L、pH 8.5 的 Tris-HCl緩沖液在4℃透析過夜，以除去多余的修飾劑，得到丁二酸酐修飾的氨肽酶 （修飾酶SA-AE）；稱取20 mg的氨肽酶粉溶解在15 mL、0.05 mol/L pH 8.5的Tris-HCl緩沖液中，用0.05 mol/L pH8.5的Tris-HCl緩沖液在4℃透析過夜，得到原酶液（AE），4℃冰箱保存。

1.2.2 紫外-可見吸收光譜 采用UV-3000掃描型紫外分光光度計(jì)，掃描波長(zhǎng)為200～600 nm，石英比色皿光程為10 mm，酶質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg/mL。

1.2.3 圓二色性光譜 采用MOS-450圓二色光譜儀，波長(zhǎng)范圍為 190～250 nm，速度 1 nm/2 s，使用0.1 cm石英池，酶質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg/mL。

1.2.4 動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)的測(cè)定 以L-亮氨酸-4-硝基苯胺為底物，在原酶和修飾酶的最佳酶活測(cè)定的條件下， 測(cè)定底物濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L時(shí)原酶和修飾酶的酶活。按照Lineweaver-Burk作圖法取雙倒數(shù)作1/v-1/s曲線，計(jì)算原酶和修飾酶的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm。

1.2.5 原酶液和修飾酶液最適溫度的測(cè)定 分別取原酶液和修飾酶液各1 mL，用0.05 mol/L、pH 8.5的Tris-HCl緩沖液在不同的溫度條件下測(cè)定酶活力，溫度梯度為 40、45、50、55、60、65、70 ℃，以同組實(shí)驗(yàn)中酶活最高的一組作為對(duì)照。

1.2.6 原酶液和修飾酶液的溫度穩(wěn)定性 將原酶液和修飾酶液放置在70℃、0.05 mol/L pH 8.5的Tris-HCl緩沖液中，每隔1 h取樣，立即冰浴，測(cè)定其酶活力，以同組實(shí)驗(yàn)中酶活最高的一組作為對(duì)照。 水浴保溫時(shí)間為 0、1、2、3、4、5 h。

1.2.7 原酶液和修飾酶液最適pH值的測(cè)定 分別取原酶液和修飾酶液各1 mL，在不同pH、0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液中、50℃下測(cè)定其酶活力，pH值梯度為 6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0。 以同組實(shí)驗(yàn)中酶活最高的一組作為對(duì)照。

1.2.8 原酶液和修飾酶液的pH穩(wěn)定性 將原酶液和修飾酶液分別在pH 5.0～7.0（0.05 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液）、pH 7.0～10.0（0.05 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液）體系中于4℃下放置，6 h后取樣將pH調(diào)至它們的最適反應(yīng)pH值以測(cè)定酶活力。以同組實(shí)驗(yàn)中酶活最高的一組作為對(duì)照。

1.3 分析方法

1.3.1 氨肽酶酶活測(cè)定方法 LNA法:加入2 mL、0.05 mol/L、pH 8.5的 Tris-HCl緩沖液，1 mL的 L-亮氨酸對(duì)硝基苯胺溶液，再加入稀釋一定倍數(shù)的酶液1 mL，50℃水浴反應(yīng)10 min后，在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值[10]。

酶活力定義:50℃下，每分鐘分解L-亮氨酸對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生1 μmol的對(duì)硝基苯胺所需酶量定義為一個(gè)酶活單位。

1.3.2 平均氨基修飾度測(cè)定 采用三硝基苯磺酸（TNBS）法對(duì)修飾酶進(jìn)行平均氨基修飾度的測(cè)定[11]。

氨基修飾率（%）=1－氨基殘留率（%）。

1.3.3 相對(duì)酶活力測(cè)定 在同組實(shí)驗(yàn)中以酶活力最高的為100，與其余的酶活力之比，通常以百分?jǐn)?shù)表示。

1.3.4 酶活殘留率測(cè)定 酶活殘留率=樣品酶液殘余酶活/樣品酶液初始酶活×100%。

1.3.5 蛋白質(zhì)總量測(cè)定 考馬斯亮藍(lán)染色法[12]，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 丁二酸酐化學(xué)修飾結(jié)果

在最佳修飾條件下，采用丁二酸酐對(duì)氨肽酶進(jìn)行化學(xué)修飾，得到化學(xué)修飾酶。修飾酶的相對(duì)酶活為105.81%，較原酶有所提高，氨基修飾率為55.86%。與透析前相比，透析后原酶液和修飾酶液的酶活均有所下降，這是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌Zj016氨肽酶是一種金屬酶[13]，透析導(dǎo)致部分金屬離子除去，酶活下降。可通過加入適當(dāng)濃度的相應(yīng)金屬離子提高酶活。

2.2 修飾酶的結(jié)構(gòu)與催化特性表征

2.2.1 紫外-可見吸收光譜分析 蛋白質(zhì)在紫外光范圍內(nèi)有兩個(gè)特征吸收峰，一是由于蛋白質(zhì)所含有的色氨酸殘基和酪氨酸殘基，其分子內(nèi)部存在共軛雙鍵，在280 nm處有一個(gè)吸收峰，二是因肽鍵存在而引起的，在200～220 nm處有一個(gè)吸收峰。由圖1可知，原酶液的最大吸收波長(zhǎng)在213.5 nm處，經(jīng)過修飾之后，修飾酶的最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移，為216.5 nm。其原因可能是丁二酸酐的引入改變了酶分子的微環(huán)境，n和π*軌道間的能量差減小，引起吸收峰向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng)[14]。吸收峰的微小變化表明丁二酸酐修飾后已導(dǎo)致酶分子的構(gòu)象發(fā)生了一定程度的改變。

2.2.2 圓二色性光譜分析 在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，存在著α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的α螺旋結(jié)構(gòu)在靠近192 nm處有一正的譜帶，在222 nm和208 nm處表現(xiàn)出兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶；β折疊的CD譜在216 nm有一個(gè)負(fù)譜帶，在185～200 nm有一正譜帶；β折疊在206 nm附近有一正CD譜帶[15]。由圖2可知，原酶液和修飾酶液的CD光譜特征產(chǎn)生了一定的變化，進(jìn)一步說明酶經(jīng)修飾后其結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖1 原酶液和修飾酶液的紫外吸收光譜Fig.1 Absorbancespectra ofnativeand modified Aminopeptidase

圖2 原酶液和修飾酶液的圓二色性光譜圖Fig.2 CD spectra of native and modified Aminopeptidase

用Selcon3軟件分析修飾前后酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化，結(jié)果見表1。由表1可見，酶經(jīng)修飾后，α螺旋、β折疊以及β轉(zhuǎn)角的含量均有所下降，無規(guī)則卷曲的含量有所增加。在經(jīng)化學(xué)修飾引入丁二酸酐之后，酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

表1 原酶液與修飾酶液的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Table 1 Secondary structure of native and modified Aminopeptidase

2.2.3 修飾氨肽酶的催化特征 在丁二酸酐修飾前后，分別考察了原酶和修飾酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以雙倒數(shù)作圖法作圖，Lineweaver-Burk曲線見圖3，求得反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。

圖3 原酶和修飾酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-burk plot of native and modified Aminopeptidase

表2 原酶和修飾酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of native and modified Aminopeptidase

由表2可知，與原酶相比，修飾酶的Km值減小，表明修飾劑的加入導(dǎo)致氨肽酶的空間構(gòu)象發(fā)生了改變，使其對(duì)底物L(fēng)-亮氨酸-4-硝基苯胺的親和力增加，更加有利于底物分子進(jìn)入酶的活性中心。

2.2.4 原酶液和修飾酶液的最適溫度 由圖4可知，不管是原酶液還是修飾酶液，其酶活均隨著溫度的上升而增加，原酶液的最適溫度是60℃，而修飾酶液的最適溫度是65℃，較原酶液有所提高。

圖4 原酶液和修飾酶液的最適作用溫度Fig.4 Optimalreaction temperatureofnativeand modified Aminopeptidase

2.2.5 原酶液和修飾酶液的熱穩(wěn)定性 由圖5可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，原酶液和修飾酶液酶活的變化趨勢(shì)相同，但是，修飾酶液在70℃保溫5 h后，仍然保留70%的酶活，而原酶液的酶活僅余35%。和原酶液相比，修飾酶液具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖5 原酶液和修飾酶液的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermalstability of native and modified Aminopeptidase at 70℃

至于酶經(jīng)化學(xué)修飾后熱穩(wěn)定性提高的原因，不同學(xué)者都圍繞著修飾后酶分子結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行討論。如Baek等[16]認(rèn)為可能是由于修飾劑共價(jià)連接在酶分子后，使其天然構(gòu)象局部產(chǎn)生一定的“剛性”，不易伸展失活，并減少了酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動(dòng)，從而提高酶的熱穩(wěn)定性；Gouda等[17]認(rèn)為修飾劑與酶分子共價(jià)連接后，使得酶分子的結(jié)構(gòu)變得致密，其分子內(nèi)的作用力增強(qiáng)，導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性提高。

2.2.6 原酶液和修飾酶液的最適pH值 由圖6可知，原酶液的最適pH值為8.5，修飾酶液的最適pH值為9.5～10.0。原酶液在pH值為10.0時(shí)的相對(duì)酶活為90%。經(jīng)丁二酸酐修飾后，酶的最適pH值向堿性方向偏移了1～1.5個(gè)單位。

圖6 原酶液和修飾酶液的最適作用pH值Fig.6 Optimal reaction pH of native and modified Aminopeptidase

Khaparde等[18]采用丁二酸酐修飾木瓜蛋白酶導(dǎo)致最適反應(yīng)pH值由6.0偏移至7.5，熊亞紅等[19]用鄰苯二甲酸酐（PA）修飾木瓜蛋白酶使其最適反應(yīng)pH值由7.0提高到8.5。人們普遍認(rèn)為這可能是由于酸酐與酶分子的Lys殘基上帶正電荷的氨基反應(yīng)后，在酶分子中引入了帶負(fù)電荷的羧基，使得最適pH向堿性方向偏移。

2.2.7 原酶液和修飾酶液的pH穩(wěn)定性 由圖7可知，在4℃放置6 h后，緩沖液的種類對(duì)酶活的測(cè)定也有影響，所以在更換緩沖液之后，pH 7時(shí)相對(duì)酶活力出現(xiàn)不同。以最高酶活的80%為界確定酶的pH穩(wěn)定范圍，原酶在pH 7.0～9.0范圍內(nèi)，酶活力較高且穩(wěn)定；而修飾酶在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，pH穩(wěn)定性范圍比原酶變寬，說明修飾酶的pH穩(wěn)定性得到提高。

圖7 原酶液和修飾酶液的pH穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of native and modified Aminopeptidase

3 結(jié)語

作者采用丁二酸酐在經(jīng)過一定優(yōu)化的最佳修飾條件下對(duì)氨肽酶進(jìn)行化學(xué)修飾，修飾后的枯草芽孢桿菌氨肽酶酶活較原酶有所提高，分子構(gòu)象發(fā)生了一定的改變，同時(shí)伴隨了一系列的酶學(xué)特性表征方面的變化。修飾后酶學(xué)特征中最突出的變化是修飾酶的熱穩(wěn)定性比原酶顯著增強(qiáng)，對(duì)底物的親和力也有所增加，表明特定條件下的丁二酸酐化學(xué)修飾可較好改善枯草芽孢桿菌氨肽酶的應(yīng)用特性，對(duì)促進(jìn)該酶的工業(yè)化生產(chǎn)和進(jìn)一步的應(yīng)用有一定的參考作用。

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