劉虎軍， 羅 瑋， 范新蕾， 余曉斌

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

葡萄糖氧化酶 （GOD，β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase，EC 1.1.3.4）是一種糖蛋白類(lèi)的氧化酶，能夠?qū)ⅵ?D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成水和氧氣，葡萄糖酸內(nèi)酯能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸[1]。葡萄糖氧化酶被廣泛應(yīng)用在食品、飼料、醫(yī)藥、傳感器等行業(yè)中，例如:作為食品添加劑能夠去除葡萄糖從而減緩美拉德反應(yīng)的發(fā)生以防止產(chǎn)品在加工過(guò)程中出現(xiàn)褐變[2]；能夠在一定程度上降低蛋白清的致敏性[3]；能夠去除啤酒、葡萄酒、軟飲中的氧氣以提高產(chǎn)品的質(zhì)量和貨架期[4]；作為飼料添加劑能夠改善動(dòng)物腸道環(huán)境促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[5]；葡萄糖氧化酶是新型傳感器中的重要的組成部分，可以用來(lái)測(cè)定糖含量[6]；此外利用基因工程技術(shù)還可以將葡萄糖氧化酶基因克隆到植物體中用來(lái)抗蟲(chóng)抗病[7]。

目前，葡萄糖氧化酶主要采用黑曲霉和青霉進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)獲得[8]，但是存在發(fā)酵條件復(fù)雜、產(chǎn)量較低、發(fā)酵產(chǎn)物復(fù)雜和后期純化成本高、難以獲得較高純度的酶制劑等缺點(diǎn)[9]。很多學(xué)者試圖利用基因工程手段改良和提高葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)，例如:增加黑曲霉菌株中葡萄糖氧化酶基因的劑量[10]，在瑞氏木霉[11]等霉菌中表達(dá)、在原核菌株中表達(dá)[12]、在畢赤酵母中表達(dá)[13]等。其中利用甲醇畢赤酵母表達(dá)葡萄糖氧化酶基因具有較為明顯的優(yōu)勢(shì):畢赤酵母的遺傳背景清晰、表達(dá)系統(tǒng)高效，同時(shí)甲醇畢赤酵母的高密度發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)非常有利于工業(yè)化生產(chǎn)[14]。然而，畢赤酵母中表達(dá)的外源葡萄糖氧化酶產(chǎn)量和酶活力仍然較低，遠(yuǎn)不能與其他產(chǎn)酶基因工程菌的表達(dá)水平相比較。

本實(shí)驗(yàn)旨在克隆來(lái)源于黑曲霉PCTC的葡萄糖氧化酶基因，在畢赤酵母GS115中異源表達(dá)，以期獲得高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)用菌株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 黑曲霉菌株P(guān)CTC:由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Top10，JM109:用來(lái)構(gòu)建和克隆目的基因；畢赤酵母GS115:用來(lái)表達(dá)目的基因； 質(zhì)粒 pMD18-T （Takara Biotechnology，Dalian Branch）:用來(lái)構(gòu)建克隆載體；質(zhì)粒pPIC9K:用來(lái)表達(dá)目的基因。

1.1.2 試劑與儀器 PCR相關(guān)試劑、T克隆相關(guān)試劑和限制性內(nèi)切酶:購(gòu)自Takara公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒和G418等:購(gòu)自上海生工生物有限公司；瓊脂糖、辣根過(guò)氧化物酶和鄰聯(lián)茴香胺等試劑:購(gòu)自Sigma公司；色譜純甲醇及其他試劑（AR）:均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。PCR儀和電轉(zhuǎn)化儀:Eppendorf公司；電泳儀:北京六一儀器廠。

1.1.3 培養(yǎng)基 黑曲霉活化培養(yǎng)基用POD培養(yǎng)基，大腸桿菌的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化用LB培養(yǎng)基。酵母的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化和蛋白的誘導(dǎo)生成用YPD、MD、MM、BMGY及BMMY等培養(yǎng)基。培養(yǎng)基組成成分如下:

1）POD培養(yǎng)基:將洗凈的去皮的馬鈴薯200 g切成小塊，煮沸30 min，過(guò)濾，加入20 g葡萄糖，加水定溶到1 000 mL，自然pH值，121℃下滅菌20 min；

2）LB:蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，氯化鈉 10 g，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.4，定容至1 000mL；121℃下滅菌20 min；

3）YPD:蛋白胨 20 g，酵母膏 10 g，葡萄糖 20 g，定容至1 000mL；自然pH值，121℃下滅菌20 min；

4）MD:酵母基本氮源培養(yǎng)基（YNB）1.7 g，硫酸銨5 g，葡萄糖200 g，定容至1 000mL；自然pH值，121℃下滅菌20 min。加入500×B（過(guò)濾滅菌）2 mL；

5）MM:YNB1.7 g，硫酸銨 5 g，甲醇 12 mL，定容至1 000 mL；自然pH值，121℃滅菌20 min。加入500×B（過(guò)濾滅菌） 2 mL；

6）BMMY培養(yǎng)基:酵母浸出物 10 g，蛋白胨20 g，加入800 mL水中，121℃下滅菌20 min，冷至室溫， 加入滅好菌的 PBS 100 mL，10×YNB 100 mL，500×B 2 mL（過(guò)濾滅菌），甲醇 5 mL；

7）BMGY培養(yǎng)基:酵母浸出物10 g，蛋白胨20 g，加入700 mL水中，121℃下滅菌20 min，冷至室溫 加 入 滅 好 菌 的 PBS100 mL，10×YNB 100 mL，500×B 2 mL（過(guò)濾滅菌），10×GY 100 mL；

8）顯色培養(yǎng)基:將10 mL的1%瓊脂加熱溶化并冷至50℃左右后加入3 mL的顯色液（1 mL溶液2中加入 100 μL溶液 1和 200 μL溶液 3混勻，補(bǔ)加緩沖液到3 mL）。溶液1:0.1 g鄰聯(lián)茴香胺溶于10 mL甲醇中，4℃保存；溶液2:10%D-葡萄糖；溶液3:60 U/mL的辣根過(guò)氧化物酶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑曲霉基因組DNA的提取和目的基因的克隆

1）黑曲霉PCTC菌體預(yù)處理:采用POD培養(yǎng)基平板活化黑曲霉PCTC，于28℃下培養(yǎng)24 h，刮取孢子配置成懸液，接種到含有50 mL種子液的250 mL搖瓶中，取培養(yǎng)好的種子液以相同的方法接種到含有1.5% 吐溫-60（TW-60）的搖瓶中，于 200 r/min、30℃搖床中培養(yǎng)24 h。將數(shù)顆滅菌的玻璃珠加入到搖瓶中，置于200 r/min搖床中振蕩3～4 h，取1～1.5 mL的菌液8 000 r/min離心，去掉上清液，用生理鹽水洗滌兩次，再次離心收集菌體。

2）基因組DNA的提取:采用氯化芐法[15]提取黑曲霉PCTC的基因組DNA。

3）目的基因的獲得:設(shè)計(jì)如下引物:

GOD-R:TTGCGGCCGCTCACTGCATGGAAGCA TAATCTTCCAAG

GOD-F:GCTTACGTAAGCAATGGCATTGAAGC CAGCCTCCT

其中斜體部分分別為Not1、Snab1酶切位點(diǎn)，以黑曲霉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，在T4連接酶的作用下連接到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化E.coli JM109，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆子，同時(shí)提取pMD18-GOD質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建和宿主轉(zhuǎn)化 用Snab1和Not1分別將pPIC9K和pMD18-GOD質(zhì)粒酶切。pPIC9K酶切產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化，pMD18-GOD質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化。在T4連接酶的作用下構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-GOD，轉(zhuǎn)化E.coli Top10，經(jīng)氨芐抗性平板篩選和菌落PCR鑒定，同時(shí)送至上海生工測(cè)序驗(yàn)證，保存測(cè)序正確的菌株，利用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，將電擊轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞在MD培養(yǎng)基上培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.2.3 GOD高效表達(dá)株的篩選 將上述獲得的轉(zhuǎn)化子制備成菌液涂布在含有G418的梯度平板上，G418質(zhì)量濃度梯度從0 mg/mL到3 mg/mL，培養(yǎng)溫度為30℃，挑選在高濃度下生長(zhǎng)的單菌落，再將其分別點(diǎn)種在MM和MD平板中，以確定其表型。培養(yǎng)出單菌落后將MD平板置于4℃冰箱中保存，然后利用平板篩選法[16]，將10 mL顯色培養(yǎng)基傾倒在MM平板上。30℃下放置1 h，然后將其放于4℃冰箱中顯色。將顯色圈較大的陽(yáng)性克隆子接種在3 mL BMGY培養(yǎng)基上，30℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，用3 mL的BMMY培養(yǎng)基重懸，在相同的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)表達(dá)，每24 h補(bǔ)充300 μL甲醇，搖床培養(yǎng)4 d后測(cè)定上清液中酶活性大小，確定高產(chǎn)菌株。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 為了提高畢赤酵母的產(chǎn)酶活性，作者對(duì)接種量、pH值、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)甲醇濃度、裝液量和誘導(dǎo)時(shí)間等6個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化。將重組菌接種在含有100 mL的YPG培養(yǎng)基的500 mL的搖瓶中，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h，以5%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到含有BMGY培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，在30℃、200 r/min下培養(yǎng)16～24 h，直到OD600達(dá)到5～6時(shí)，靜置1～2 h以消耗剩余的甘油并且使菌體沉淀。然后倒掉上層培養(yǎng)基，用一定體積的BMMY培養(yǎng)基重懸，以后每24 h補(bǔ)加1%的甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶。甲醇體積分?jǐn)?shù)選擇0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%五個(gè)濃度；接種體積分?jǐn)?shù)選擇25%、50%、100%和150%四個(gè)梯度；pH 設(shè)置為 3、4、5、6和7五個(gè)梯度；誘導(dǎo)溫度分別設(shè)為22、25、28、30 ℃； 裝液量選擇 15、20、30、40、50 mL 五個(gè)梯度；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化以每天取樣測(cè)定酶活性、OD600來(lái)確定最佳發(fā)酵時(shí)間。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，分別測(cè)定酶活性和OD值。

1.2.5 酶活性的測(cè)定 酶活性測(cè)定方法根據(jù)Sigma和周建芹[17]公司的方法并加以改進(jìn):配置21 μmol/mL的雙氧水標(biāo)準(zhǔn)液，反應(yīng)體系中含有2.5 mL的0.21 mmol/L的鄰聯(lián)茴香胺溶液，0.4 mL的10%葡萄糖溶液，0.1 mL的60 U/mL的辣根過(guò)氧化物酶，再加入1 mL不同濃度的雙氧水，在35℃下預(yù)熱5 min，加水補(bǔ)到10 mL，在OD500下測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，以濃度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定用1 mL稀釋好的樣品代替雙氧水，反應(yīng)1～5 min測(cè)定OD值然后計(jì)算酶活性大小，酶活性單位定義為:37℃下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol的雙氧水所需要的酶量為一個(gè)酶活單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉PCTC基因組DNA的提取和葡萄糖氧化酶基因克隆

將配制的黑曲霉孢子懸液（OD500=0.4）以不同的接種體積分?jǐn)?shù)接種于搖瓶，培養(yǎng)24 h后加入等量的玻璃珠，搖床振蕩4 h。未添加玻璃珠處理的培養(yǎng)液中，菌絲體集結(jié)形成菌球，難以提取出基因組DNA，用玻璃珠處理后則相對(duì)容易地提取出基因組DNA，這是因?yàn)椴捎貌Ａе樘幚硎咕z處于分散狀態(tài)，有利于氯化卞和細(xì)胞壁充分接觸。接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)基因組DNA的提取也產(chǎn)生很大的影響，接種量小于0.5%時(shí)容易形成較大菌球，當(dāng)菌球直徑大于0.2 mm時(shí)，即使用玻璃珠處理也無(wú)法提取出基因組DNA。另外TW-60有利于基因組DNA的提取，因?yàn)樘砑?.5%的TW-60能夠有效減小菌球的直徑和離散菌絲體。

以黑曲霉PCTC基因組為模板克隆獲得了GOD基因，見(jiàn)圖1。目的基因條帶單一、濃度較高。圖2中4號(hào)和5號(hào)為兩個(gè)白色菌落的菌落PCR，第三條帶為藍(lán)斑質(zhì)粒DNA線性化的條帶，4號(hào)5號(hào)菌株經(jīng)測(cè)序其全長(zhǎng)為1 772 bp，將其提交Genbank所獲序列登錄號(hào)是JX105360與Genbank中其他葡萄糖氧化酶基因的序列的相似度在92%～98%之間，預(yù)期能夠編碼含有589個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。對(duì)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)序列中不含有內(nèi)含子和基因原有的信號(hào)肽序列，不含有Sac1、Not1和Snab1酶切位點(diǎn)，含有Ecor1酶切位點(diǎn)，符合之前的預(yù)測(cè)。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

分別用SnabI和NotI對(duì)pMD18-T-GOD和pPIC9K做分步酶切，結(jié)果見(jiàn)圖3。切膠回收位于2000 bp處的條帶，pPIC9K酶切后用PCR回收試劑盒純化回收，以適當(dāng)比例混合后在16℃下進(jìn)行連接。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可以看出2、4、6、8和9號(hào)都出現(xiàn)目的條帶，送2號(hào)測(cè)序，由測(cè)序結(jié)果可以看出目的基因正確的插入到pPIC9K中。

圖1 目的基因克隆PCR電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR assay of the Target gene

圖2 藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 PCR assay of the positive clones

圖3 重組質(zhì)粒pMD18-T-GOD的酶切鑒定Fig.3 Restriction pattern of recombinant pMD18-T-GOD

圖4 重組質(zhì)粒pPIC9K-GOD的PCR鑒定結(jié)果Fig.4 PCR assay of recombinant pPIC9K-GOD

2.3 畢赤酵母宿主菌轉(zhuǎn)化和篩選

大量提取2號(hào)質(zhì)粒做電轉(zhuǎn)化，從MM平板、G418梯度平板篩選獲得了20個(gè)陽(yáng)性克隆子。再用顯色平板篩選所獲得的陽(yáng)性克隆，見(jiàn)圖5。從圖5可以看出，A、B、C三個(gè)菌落的顯色圈大小不同，經(jīng)測(cè)定A酶活性最高，B酶活性較低，C基本沒(méi)有酶活，說(shuō)明該方法可以用來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化株的有效篩選。

對(duì)篩選得到的20株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，其中菌株GOD2-14經(jīng)誘導(dǎo)獲得了最高的酶活性（0.128 U/mL）。將菌株分別接種在MM平板和MD平板上培養(yǎng)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子在MM平板上和MD平板上長(zhǎng)勢(shì)相近，其表型為HIS+MUT+。

圖5 重組酵母顯色平板鑒定結(jié)果Fig.5 Plat assay for GOD production

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

對(duì)pH、接種量、甲醇濃度、裝液量、培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等六個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)pH設(shè)置為5時(shí)，重組酵母的葡萄糖氧化酶表達(dá)活力比在4和6時(shí)高，到培養(yǎng)第七天時(shí)，其表達(dá)的酶活性比pH為4和6分別高34%和33%（圖6a）。這有可能是葡萄糖氧化酶在堿性條件下不穩(wěn)定的原因造成的[18]。不同接種體積分?jǐn)?shù)的影響結(jié)果見(jiàn)圖6b，接種體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，其發(fā)酵液酶活性最高；甲醇濃度對(duì)產(chǎn)酶也有很大影響，由圖6c可以看出隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，酶活性和菌濃度顯著增加，當(dāng)其體積分?jǐn)?shù)達(dá)到2%的時(shí)候酶活性不再提高，反而有下降的趨勢(shì)，這說(shuō)明甲醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)會(huì)抑制重組菌產(chǎn)酶；隨著裝液量的增加細(xì)胞濃度不斷降低，酶活性也隨之降低，見(jiàn)圖6d；裝液量直接影響溶氧，裝液量較高，溶氧不足，細(xì)胞濃度較低，酶活性也隨之降低，但是由于裝液量太小時(shí)不利于后期的取樣和甲醇的添加，所以選取25 mL的裝液量做為最佳值；不同溫度下誘導(dǎo)產(chǎn)酶發(fā)現(xiàn)，22℃下產(chǎn)酶較高，隨著溫度的升高產(chǎn)酶量下降，這說(shuō)明低溫有利于菌株產(chǎn)酶，圖6e；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，菌體密度持續(xù)增加，酶活性也不斷的增加，兩者存在正相關(guān)性，在第7天時(shí)酶活性達(dá)到最高，為14.23 U/mL，見(jiàn)圖6f。通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，獲得了最佳發(fā)酵條件為200 r/min、pH 5、接種體積分?jǐn)?shù)50%、裝液量為20 mL，25℃下經(jīng)1.5%甲醇誘導(dǎo)7～8 d，獲得的最高酶活為25 U/mL，是優(yōu)化前的73倍。

3 結(jié)語(yǔ)

圖6 重組菌發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.6 Optimization of fermentation conditions

從一株高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的黑曲霉PCTC中獲得了葡萄糖氧化酶基因的完整序列，并進(jìn)行了克隆和表達(dá)的研究，獲得了一株具有較強(qiáng)表達(dá)能力的重組菌。

本研究對(duì)通用的絲狀真菌基因組DNA提取方法進(jìn)行了改進(jìn)，在加入氯化卞破壁前，用滅菌玻璃珠對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，獲得了黑曲霉基因組DNA。該方法相對(duì)于液氮和溶菌酶的前處理方法，操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)安全而且能滿足后續(xù)試驗(yàn)要求，因此更加適用于絲狀真菌基因組DNA的提取。重組菌能夠在以甲醇為惟一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并在其誘導(dǎo)下高效表達(dá)葡萄糖氧化酶基因，以1.5%的甲醇誘導(dǎo)7～8 d，其酶活性達(dá)到20～25 U/mL。周亞鳳[17]等利用pPIC9質(zhì)粒成功將來(lái)源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母GS115中表達(dá)，獲得30～40 U/mL的酶活；Yao Guo[14]等利用pPICαA質(zhì)粒將來(lái)源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母SMD1168中表達(dá)，獲得40 U/mL的酶活性。一般認(rèn)為不同的表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)宿主對(duì)外源基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生很大的影響；當(dāng)外源蛋白質(zhì)在宿主中表達(dá)時(shí)，常常由于密碼子偏好性不同導(dǎo)致產(chǎn)量低甚至不表達(dá)；表達(dá)菌株的甲醇利用表型與表達(dá)盒的染色體整合位點(diǎn)和方式也會(huì)影響外源基因的表達(dá)。因此，通過(guò)篩選高表達(dá)菌株、密碼子優(yōu)化、選用不同的線性化位點(diǎn)、利用不同的表達(dá)載體和宿主菌以及信號(hào)肽優(yōu)化會(huì)進(jìn)一步提高重組菌的GOD表達(dá)水平。

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