肖 珊，黃立新，趙璧秋

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640；2.廣州市華僑糖廠，廣東廣州510280）

鈣為人體內(nèi)含量最多的一種無機元素，所有的生命過程基本上均需要鈣的參與[1-2]，缺鈣可導(dǎo)致人體產(chǎn)生骨質(zhì)疏松、佝僂癥等多種疾病[3]。到目前為止，經(jīng)中國食品藥品監(jiān)督管理局批準的鈣制劑保健食品有近900個，鈣類藥品達1740多個[4]。盡管補鈣產(chǎn)品種類豐富，但鈣的生物利用度低，導(dǎo)致補鈣效果與補鈣量不成正比，尋找新技術(shù)改善補鈣制劑的補鈣效果倍受國內(nèi)外的關(guān)注。導(dǎo)致人體缺鈣的主要原因有：在正常人中，鈣結(jié)合蛋白對鈣的轉(zhuǎn)運能力是一個常量，單純依靠鈣結(jié)合蛋白為細胞內(nèi)提供鈣并不能滿足機體需要；離子鈣在胃、小腸的酸度條件下，Ca2+易生成不溶物，導(dǎo)致其吸收率下降[3-5]。

Agar（1953）[6]、Adibi（1984）[7]、Hara（1984）[8]、Rerat（1988）[9]的實驗結(jié)果證實了“小肽優(yōu)先吸收理論”：小肽中氨基酸殘基的吸收速率要大于等量游離氨基酸的吸收速率。依此，國內(nèi)外的科研者們陸續(xù)展開了小肽與鈣螯合反應(yīng)的研究，并得到“小肽與鈣螯合，不易飽和，吸收速度快，耗能低，更有利于提高鈣的生物學(xué)效價”的結(jié)果[10-15]。

乳清蛋白被譽為是“蛋白之王”，具有高吸收性、完整的氨基酸成分、低脂肪和膽固醇的特點[16]，是當今最常見的蛋白質(zhì)補充產(chǎn)品之一[17]。目前，國內(nèi)外科研者多以魚骨架、牛骨、雞羽毛、雞肉、豆粕、米渣、血粉、蛋清等為原料，水解制得蛋白肽，與鈣螯合后得到“蛋白肽螯合鈣”。本文以乳清蛋白為原料制取多肽，再與鈣鹽反應(yīng)制得乳清多肽螯合鈣，為多肽螯合鈣產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濃縮乳清蛋白WPC80 美國Hilmar公司；堿性蛋白酶（酶活＞200000U/g） 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；無水氯化鈣、氫氧化鈉、乙醇（95%） 分析純。

pHS-3C精密pH計 上海雷磁；FA2004B電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠；恒溫水浴鍋 北京永光明醫(yī)療儀器廠；TDL-5-A離心機 上海安亭（飛鴿）；NICOLET-6700紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；UV500紫外可見分光光度計 英國UNICAN；X’Pert PRO X-射線衍射光譜儀 荷蘭帕納科公司；TGA Q500熱重分析儀 美國Waters公司；Hitachi S3700N掃描電鏡 H itachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳清多肽的制備 配制一定濃度的乳清蛋白溶液（5g/100m L），調(diào)節(jié)pH至10.5，60℃恒溫10m in，加入蛋白酶0.3g，振蕩水解5h。水解結(jié)束后置沸水浴中滅酶10min，取出迅速冷卻，50℃烘干、研磨（至過80目篩）。測得乳清多肽水解度約30%。

1.2.2 乳清多肽螯合鈣的制備與提純 配制濃度為2%的乳清多肽溶液，NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，加入鈣鹽，攪拌溶解，在恒溫振蕩水浴中反應(yīng)一定時間，用反應(yīng)液15倍以上體積乙醇沉淀，3500r/m in離心10m in收集沉淀，乙醇洗滌至上清液加入鈣指示劑不變色（仍顯示藍色），加入茚三酮指示劑加熱后不變紫，50℃烘干，研磨拌研磨（至過100目篩）得產(chǎn)品[18-19]。

1.2.3 合成乳清多肽螯合鈣的單因素實驗 實驗中以0.06g乳清多肽配制成30m L水溶液為基礎(chǔ)，溶液分別以鈣鹽質(zhì)量（0.01、0.2、0.3、0.6、1.0、1.2、1.5、2.0、3.0、4.0g），溶液初始pH（5、6、7、8、9、10、11、12），反應(yīng)溫度（35、45、55、60、65、75℃），時間（5、10、20、30、40、50、60min）為影響因素，以鈣含量或螯合率為指標，考察各因素對螯合鈣反應(yīng)的影響。反應(yīng)基本條件依次為：pH 8、60℃、反應(yīng)時間60m in、鈣鹽質(zhì)量1.2g。

1.2.4 合成乳清多肽螯合鈣的正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果選取合適的因素水平，以鈣螯合率為指標，設(shè)計四因素三水平正交實驗，因素水平見表1。

表1 乳清多肽螯合鈣合成的正交實驗因素水平表Table1 Factors and levels ofwhey polypeptide chelating calcium orthogonal experiment

1.2.5 鈣螯合率的測定

1.2.5.1 鈣含量的測定方法 參照GB/T 5009.92-2003食品中鈣的測定中的滴定法（EDTA法）[20]。其中10g/L氰化鈉溶液用三乙醇胺溶液（與蒸餾水體積比1∶2）替代，每次滴定前加入2～3m L。

1.2.5.2 總鈣含量的測定 準確移取0.1m L反應(yīng)液于三角瓶中，加入50m L蒸餾水，加入2～3m L三乙醇胺（1∶2），搖勻，用滴定管加0.8～1m L 1.25mol/L氫氧化鉀溶液至pH為12～13，搖勻，加入適量鈣指示劑，搖勻，立即以稀釋10倍EDTA溶液（已標定每m L EDTA相當于0.0456mg Ca）滴定，至溶液由紫紅色變純藍色為止，記EDTA溶液體積V0。按公式（1）可計算可得總鈣含量M0（g）：

1.2.5.3 螯合鈣含量的測定 準確移取1m L反應(yīng)液于50m L離心管中，加入20m L乙醇，溫水浴中振搖1h，3500r/m in離心10m in，棄上清液，沉淀定容至20m L溶液，取2m L溶液EDTA滴定，同1.2.5.2步驟，記EDTA溶液體積V1?？砂垂剑?）得螯合鈣含量M1（g）：

1.2.5.4 鈣螯合率 計算方法如公式3所示：

式中：M0、M1分別表示0.1m L反應(yīng)液中總鈣的含量、螯合鈣的含量（g）。

1.2.6 乳清多肽螯合鈣的表征

1.2.6.1 掃描電鏡和能譜分析 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣粉末分別用掃描電鏡觀察拍攝樣品形態(tài)，并在加速壓20.00kv的條件下進行能譜分析。

1.2.6.2 紅外光譜分析 采用KBr壓片法，累加掃描次數(shù)32次。

1.2.6.3 紫外光吸收曲線 配制濃度為1%的乳清多肽與乳清多肽螯合鈣溶液，于波長190～350nm下掃描。

1.2.6.4 鈣含量分析 精確稱取約0.0100g的乳清多肽與最佳工藝條件下合成的乳清多肽螯合鈣，溶解在5m L容量瓶中定容。取2m L溶液，采用1.2.5中EDTA滴定法測定鈣含量，計算得到樣品中鈣的質(zhì)量分數(shù)。

1.2.6.5 TGA熱重分析 樣品質(zhì)量約2.5mg。氮氣流量：天平40m L/m in，樣品60m L/min，升溫速率為：30℃/m in，溫度范圍為40～1000℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 鈣鹽用量的影響 乳清多肽螯合鈣反應(yīng)的理想情況是一定量的乳清多肽能與盡可能多的鈣離子發(fā)生螯合，亦即所得單位質(zhì)量產(chǎn)物中鈣離子含量最多。螯合反應(yīng)產(chǎn)物中鈣離子含量（%）與加入鈣鹽質(zhì)量（g）的變化關(guān)系如圖1所示。

圖1 鈣鹽質(zhì)量對螯合產(chǎn)物中鈣含量的影響Fig.1 Effectof calcium ion weighton the Ca2+content in product

由圖1可知，在0.01～2g內(nèi)，隨著鈣鹽加入越多，螯合產(chǎn)物中鈣含量也逐漸增加。當鈣鹽質(zhì)量增至3～4g間，螯合產(chǎn)物中鈣含量趨于不變。因此，確定加入鈣鹽的質(zhì)量在3g左右，此時螯合物中的鈣含量約為10%。

2.1.2 反應(yīng)液初始pH的影響 由圖2可知，隨著反應(yīng)初始pH升高，鈣離子螯合率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當初始反應(yīng)液為酸性時，溶液中H+較多，會抑制多肽-COOH中的H+電離（式4），同時易使-NH2結(jié)合一個H+而帶上正電（式5），阻礙二者與鈣離子的螯合反應(yīng)，因此鈣螯合率較低。與此相反，當初始反應(yīng)液呈堿性時，溶液中OH-較多，有利于肽-COOH中的H+電離及-NH2失去一個H+而帶上負電（式6），均有利于二者與鈣離子的螯合反應(yīng)，因此鈣螯合率逐漸增大。但當初始反應(yīng)液pH超過11左右時，鈣螯合率又減少了，這是由于在強堿性條件下鈣離子與過多的OH-形成CaOH沉淀，而參與螯合反應(yīng)的Ca2+減少了。綜合實驗和以上的理論分析，適宜的初始反應(yīng)液pH為10～11。

圖2 反應(yīng)液初始pH對鈣離子螯合率的影響Fig.2 Effectof the initial pH of reaction liquid on Ca2+chelating rate

圖3 反應(yīng)溫度對鈣離子螯合率的影響Fig.3 Effectof reaction temperature on Ca2+chelating rate

2.1.3 反應(yīng)溫度的影響 實驗如圖3所示。隨著反應(yīng)溫度的升高，鈣離子螯合率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。反應(yīng)溫度在35～65℃時，溫度越高，鈣離子螯合率越大，這是由于分子及離子熱運動加強，使反應(yīng)物間碰撞并發(fā)生螯合的幾率增大。而當溫度大于65℃時，乳清多肽分子可能發(fā)生變性，部分團聚，導(dǎo)致能與鈣離子的反應(yīng)的基團變少，鈣離子螯合率便降低。綜合以上因素，選擇合成的適宜溫度約60～70℃。

2.1.4 反應(yīng)時間的影響 結(jié)果見圖4。可見隨著反應(yīng)時間的延長，鈣離子螯合率逐漸增大，而后趨于平緩。當反應(yīng)時間在5～20m in間時，鈣離子螯合率迅速增加；而后40～50m in時，鈣離子螯合率趨于穩(wěn)定。因此，確定反應(yīng)時間在40～50m in較適宜。

圖4 反應(yīng)時間對鈣離子螯合率的影響Fig.4 Effect of reaction time on Ca2+chelating rate

2.2 正交實驗結(jié)果及分析

正交實驗結(jié)果見表2。各因素對結(jié)果的影響為：鈣鹽量＞反應(yīng)時間＞溫度=溶液初始pH，優(yōu)化后的因素水平組合為A2B2C1D3，即當乳清多肽溶液質(zhì)量溶度為2%時，反應(yīng)溫度65℃，溶液初始pH 10.5，鈣鹽質(zhì)量為3g（乳清多肽與鈣鹽質(zhì)量比為1∶5），反應(yīng)時間50m in。驗證實驗結(jié)果顯示：此最優(yōu)條件下鈣螯合率為7.45%。

表2 乳清多肽螯合鈣合成的正交實驗結(jié)果Table2 Orthogonal experiment resultofwhey polypeptide chelating calcium

2.3 乳清多肽螯合鈣的表征

2.3.1 乳清多肽螯合鈣掃描電鏡 乳清多肽粉末與乳清多肽螯合鈣粉末的掃描電鏡圖見圖5、圖6。由圖可見乳清多肽的表面呈多孔狀，這可能是由乳清多肽水解液在干燥過程中水分汽化逸出時形成的小氣孔；能譜分析確定乳清多肽中含有Ca、K、S、P、Na等元素，其中Ca含量較少。其次，乳清多肽螯合鈣顆粒大小不一，無定形狀，表面粗糙，為交織團狀的結(jié)構(gòu)。能譜分析確定乳清多肽螯合鈣中含有Ca、Cl、S、P、Na等元素，其中Ca元素的含量較乳清多肽明顯增多。

圖5 乳清多肽電鏡顯微照片（10000×）及其能譜圖Fig.5 Electronmicroscopy（10000×）and energy spectrum diagram ofWhey peptides

圖6 乳清多肽螯合鈣電鏡顯微照片（10000×）及其能譜圖Fig.6 Electronmicroscopy（10000×）and energy spectrum diagram ofwhey polypeptide chelating calcium

圖7 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣的紅外光譜對比分析Fig.7 Infrared spectrum analysis ofwhey peptides and whey peptides chelating calcium

2.3.2 紅外光譜分析 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣樣品的紅外光譜圖見圖7。乳清多肽的紅外光譜見上方曲線，在特征區(qū)，-NH2的吸收峰在3386cm-1；指紋區(qū)，C=O的吸收峰在1647cm-1，-COO-的吸收峰在1397cm-1。乳清蛋白肽螯合鈣的紅外光譜見下方曲線，在特征區(qū)，-NH2的吸收峰移動到了3392cm-1，發(fā)生了變化，說明乳清蛋白水解肽中的-NH2鍵發(fā)生了的化學(xué)反應(yīng)；在指紋區(qū)，C=O的吸收峰紅移至1649cm-1，-COO-的吸收峰紅移至1416cm-1，可見，-COO-鍵也發(fā)生了的化學(xué)反應(yīng)，表明氨基和羧基均參與了鈣的螯合反應(yīng)。

2.3.3 紫外光吸收曲線 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣溶液紫外光吸收曲線見圖8。前者的出峰波長為212、280nm；而乳清多肽螯合鈣溶液的出峰波長為203nm，在280nm處的峰則大大減弱。乳清多肽與鈣離子螯合后，第一個特征峰由212nm移到203nm，這也證實了乳清多肽中某些基團發(fā)生了反應(yīng)。

圖8 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣的紫外吸收曲線Fig.8 Ultraviolet absorption curve ofwhey peptides and whey peptides chelating calcium

2.3.4 鈣含量分析 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣的鈣含量的測定結(jié)果見表3，乳清多肽中原本含有少量的鈣，加入鈣鹽與之反應(yīng)后大大增加了鈣的含量，結(jié)果與2.3.1的能譜檢測結(jié)果一致。

表3 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣的鈣含量分析Table3 Calcium content analysis ofwhey peptides and whey peptides chelating calcium

2.3.5 TGA熱重分析 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣的質(zhì)量隨溫度變化曲線見圖9。隨溫度的升高，樣品質(zhì)量逐漸減少。105℃前主要是水分的散失，二者水分含量相近，約3%～5%。當溫度高于200℃時，有機成分開始逐漸分解，由圖9可見，當二者質(zhì)量分數(shù)最低點趨于不變時，乳清多肽螯合鈣所需溫度（907℃）比乳清多肽所需溫度（629℃）高許多，這說明乳清多肽與鈣離子螯合后分子間及分子內(nèi)的作用力更大了，因此，要破壞此作用力使分子分解所需的溫度也就更高。熱重檢測結(jié)果可得乳清多肽的灰分含量約為4.82%，乳清多肽螯合鈣的灰分含量約為14.67%，后者比前者灰分含量高出10%左右，主要為鈣元素的含量，這一結(jié)果與2.3.1與2.3.4中的結(jié)果具有一致性。

圖9 乳清多肽與乳清多肽螯合鈣TGA熱重曲線Fig.9 TGA thermogravimetric curve ofwhey peptides and whey peptides chelating calcium

3 結(jié)論

當乳清多肽溶液質(zhì)量溶度為2%時，乳清多肽螯合鈣合成的最佳工藝為：乳清多肽與鈣鹽質(zhì)量比為1∶5，多肽溶液初始pH為10.5，反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時間為50m in，此最優(yōu)條件下鈣螯合率為7.45%，所得產(chǎn)物Ca2+含量為10.5%±0.5%。當乳清多肽與鈣離子發(fā)生螯合反應(yīng)后，產(chǎn)物顯微可見表面的多孔狀結(jié)構(gòu)及微小的顆粒，官能團-NH2、-COO-的紅外吸收峰會發(fā)生偏移，紫外光吸收曲線的波峰也會發(fā)生偏移；TGA熱重分析表明乳清多肽螯合鈣需要較高的溫度才能分解。

[1]周聰，劉洪升，高麗花.鈣強化飲料中鈣含量及其穩(wěn)定性實驗[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程，2003，3（10）：24-26.

[2]楊堤林.補鈣的科學(xué)[J].家庭中醫(yī)藥，2004，2（4）：56.

[3]韓櫻，何慧，趙寧寧，等.蛋清肽-鈣配合物體內(nèi)促鈣吸收作用研究[J].食品科技，2012，33（11）：262-265.

[4]蔣金來，王令充，吳皓，等.鈣制劑研究進展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（11）：379-382.

[5]Bronner F.An analysis of intestinal calcium transport acrossrat in stestine[J].JNutr，1995，125（5）：1971-1979.

[6]AgarWT，Hird FJ，Sidsu GS.The active absorption of amino acids by the intestine[J].JPHysiol，1953，121（5）：255-263.

[7]Adibi AS.Intestinal phase of protein as simulation inman[J].America Nutrition，1984，25（6）：1114-1122.

[8]Hara H，F(xiàn)unabikiR，Iwata M，etal.Prota labsorption of small peptides in rats under undrestraied Condi-tions[J].JNutr，1984，114（8）：1122-1129.

[9]Rerat A.Amino acid absorption and production of pancreatic hormoned in non-anaesthetized pigs after duodenal infusions of amilk enzymie hydrolysate or of free amino acids[J].Brit JNutr，1988，60（6）：121-136.

[10]Malin M.Metal-binding proteins and peptides in bioremediation and phytoremediation of heavy metals[J].Trends in Biotechnology，2001，2（9）：369-381.

[11]Fisher AEO，Naughton DP.Metal ion chelating peptideswith superoxide dismutase activity[J].Biomedicine&Pharmacotherapy，2005，59（4）：156-162.

[12]李彥春.酶解膠原蛋白多肽的制備與分析[J].中國皮革，2004，3（3）：20-24.

[14]Jung WK，Lee BJ，Kim SK.Fish-bone peptide increases caleium solubility and bioavailability in ova-riectomised rats[J].Brit JNutr，2006，95（8）：124-128.

[15]李翠芹，何臘平，仇保權(quán).氨基酸螯合鈣的研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（10）：162-164.

[16]盧曉明，王靜波，任發(fā)政，等.乳清蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2010，31（1）：262-267.

[17]韓婷，蔡東聯(lián).乳清蛋白的營養(yǎng)特點和作用[J].腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2005，12（4）：243-246.

[18]付文雯.牛骨膠原多膚鰲合鈣的制備及其結(jié)構(gòu)表征[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[19]魏凌云，錢建強，魏鵬，等.谷氨酸螯合鈣的合成條件研究[J].氨基酸和生物資源，2009，31（3）：43-46.

[20]GB/T 5009.92-2003.食品中鈣的測定[S].