陳 佩，黨 輝，2，張秋香，劉小鳴，趙建新，陳永泉，張 灝，*，陳 衛(wèi)

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

糖尿病已逐步成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手。根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）和國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）公布的定義，Ⅱ型糖尿病患者約占90%以上，因胰島素抵抗或胰島素分泌不足，患者常年伴有高血糖[1]。研究表明，多種前炎標(biāo)志物及促炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α和白介素-6等參與了糖尿病及其血管并發(fā)癥的形成，與糖尿病的發(fā)展明顯相關(guān)[2]。白細(xì)胞介素-10是一種抗炎因子，在調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)起著關(guān)鍵的作用，可有效地抑制促炎癥因子如腫瘤壞死因子-α的生成[3]。另外，也有證據(jù)表明氧化應(yīng)激在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用[4-5]。

目前口服降糖藥主要有五類，包括α-糖苷酶抑制劑、磺脲類、氯茴苯酸類、雙胍類、噻唑烷酮類藥物[6]，但是這些藥物的使用會(huì)產(chǎn)生一定的副作用。近年來(lái)，有研究證實(shí)乳酸菌具有一定的降糖作用。Yun等[7]研究表明加氏乳酸桿菌BNR17與對(duì)照組相比可顯著降低db/db小鼠的血糖水平。有研究證實(shí)乳酸菌可以顯著降低高果糖誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激和提高胰腺谷胱甘肽酶的合成，降低氧化應(yīng)激引起的胰腺炎[8-9]。以上結(jié)果表明乳酸菌可阻止或延緩各種模型糖尿病的發(fā)生。

本文所用鼠李糖乳酸桿菌是由本實(shí)驗(yàn)室分離于健康人體糞便，并且對(duì)其基本的益生特性和體外對(duì)大鼠腸道α-糖苷酶的抑制作用做了研究。本研究通過(guò)高脂飲食和注射鏈脲霉素（STZ）誘導(dǎo)建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，灌胃鼠李糖乳酸桿菌活菌制劑后觀察其血糖、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的炎癥因子以及氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的各種酶等，研究鼠李糖乳酸桿菌對(duì)Ⅱ型糖尿病是否具有降糖作用，并對(duì)其降糖機(jī)理進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳酸桿菌 江南大學(xué)食品生物與技術(shù)中心菌株保藏庫(kù)；MRS（De Mann，Rogosa，and Sharpe）培養(yǎng)基 蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸氫二銨2g，七水硫酸鎂0.1g，一水硫酸錳0.05g，吐溫-801m L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH為6.2～6.4；C57BL/6J小鼠和飼料 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；STZ 美國(guó)Sigma；吡格列酮 江蘇德源藥業(yè)有限公司；糖基化血紅蛋白、胰島素、腫瘤壞死因子-α、白介素-6及白介素-10檢測(cè)進(jìn)口分裝ELISA試劑盒 英國(guó)Abcam；內(nèi)毒素檢測(cè)進(jìn)口分裝ELISA試劑盒 美國(guó)Sigma；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽酶（GSH）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒 武漢博士得生物工程有限公司。

5415R型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf；CX41-12C02型倒置顯微鏡日本Olympus；血糖儀 臺(tái)灣博仕瓏。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凍干菌粉的制備 將凍存于-80℃的鼠李糖乳酸桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h，連續(xù)活化三代后，在4℃下6000r/m in離心10m in，棄上清液，將菌體用滅菌的生理鹽水洗滌三次后，用12%的脫脂乳溶液作為保護(hù)劑制成濃縮凍干粉存于-20℃[7]。灌胃前用生理鹽水將凍干粉重懸，調(diào)整菌液濃度為4×109CFU/m L，在37℃水浴中復(fù)蘇30m in后備用。

1.2.2 糖尿病小鼠模型的建立及分組 28只3周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4組（每組7只）：正常組（NG）、模型組（MG）、吡格列酮組（PG）和鼠李糖乳酸桿菌組（LG）?；A(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，除NG外其余3組喂食高脂飼料。LG小鼠每天灌胃250μL濃度為4×109CFU/m L的菌液直至13周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。2周后（第3周），MG、PG和LG腹腔注射STZ 100mg/kg。將一定量STZ溶于50mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中（pH 4.5），現(xiàn)配現(xiàn)用，冰浴保存，NG注射0.9%的生理鹽水[10]。造模1周后（第4周），造模成功的糖尿病小鼠其空腹血糖高于7.0mmol/L，餐后2h血糖高于11.0mmol/L[11]。PG開始灌胃吡格列酮10mg/kg直至13周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。體重，空腹和餐后2h血糖每周測(cè)量記錄一次。

1.2.3 口服葡萄糖耐量檢測(cè) 口服葡萄糖耐量檢測(cè)（OGTT）在造模成功后1周（第4周）和實(shí)驗(yàn)結(jié)束前（第13周）時(shí)進(jìn)行。小鼠禁食不禁水12h，檢測(cè)血糖含量（0m in），隨后小鼠灌胃葡萄糖溶液2g/kg后分別在15、30、60、90、120m in時(shí)檢測(cè)血糖含量。根據(jù)血糖值使用Orgin7.5繪制血糖變化曲線，并計(jì)算出糖耐量曲線下面積（Under Cerve，AUC）。

1.2.4 小鼠血清及組織的處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第13周），小鼠禁食不禁水12h后，麻醉后摘取眼球取血，樣品在4℃下4000×g離心10min后小心收集上層透明液體為血清，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

小鼠眼球取血后，脫頸椎處死，迅速取出肝臟和胰腺于冰冷的生理鹽水中漂洗拭干，肝臟稱重后剪碎倒入玻璃勻漿管中，加入9倍組織塊重量的冷生理鹽水充分研磨，使其組織勻漿化，將制備好的勻漿液3000×g離心15m in，吸取上清為肝勻漿液，凍存于-80℃?zhèn)溆?。胰腺?%的甲醛溶液固定。

1.2.5 血清中糖尿病相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 采用酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中糖基化血紅蛋白、胰島素、內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子-α、白介素-6和白介素-10的含量，方法參照ELISA試劑盒說(shuō)明書。

1.2.6 肝勻漿液中抗氧化指標(biāo)的檢測(cè) 肝勻漿中的谷胱氨肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、谷胱氨肽（GSH）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的檢測(cè)方法參照武漢博士得生物工程有限公司試劑盒說(shuō)明書。

1.2.7 組織切片病理觀察 取4%甲醛固定48h的胰腺組織，經(jīng)石蠟包埋后，切片，并用蘇木精和伊紅染料進(jìn)行染色（HE染色），在顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0進(jìn)行one-way ANOVA，Duncan’s和Tukey多重檢驗(yàn)（p＜0.05），數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠體重變化

實(shí)驗(yàn)期間每周監(jiān)測(cè)小鼠的體重變化（圖1）。NG小鼠體重一直呈上升趨勢(shì)，而MG小鼠體重11周后開始明顯下降，且在造模后（第3周）比其他3組小鼠的體重都要低，說(shuō)明糖尿病小鼠的體重增加緩慢。PG小鼠的體重從第7周開始漸漸高于MG，并接近NG，由此可看出吡格列酮可以改善糖尿病小鼠的體重。LG小鼠體重在3～5周顯著高于MG（p＜0.05），第8周后開始接近于NG，雖其可以改善糖尿病小鼠體重下降趨勢(shì)，但與MG比較沒(méi)有顯著性差異，這與Tabuchi等[11]研究結(jié)果一致，可能是喂食乳酸菌的時(shí)間還不夠長(zhǎng)。最后一周時(shí)，喂食乳酸桿菌的小鼠體重下降較厲害，其與模型組小鼠的體重變化一致，推測(cè)可能由于此時(shí)小鼠的糖尿病癥狀加重，達(dá)到一個(gè)階段性的峰值，故體重急劇下降。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間的小鼠體重變化Fig.1 Chang in body weight ofmice during the test

2.2 小鼠空腹及餐后血糖變化

由圖2中可看出，腹腔注射STZ一周后（第4周），MG和PG小鼠的空腹血糖遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于參考值7.0mmol/L，餐后2h血糖高于11.0mmol/L，說(shuō)明糖尿病小鼠模型建立成功。LG小鼠的空腹血糖從第4周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)都顯著（p＜0.05）低于MG小鼠的空腹血糖，并且鼠李糖乳酸桿菌可顯著（p＜0.05）抑制LG糖尿病小鼠餐后2h血糖升高。PG小鼠從第5周開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，其空腹血糖和餐后血糖都顯著低于MG小鼠（p＜0.05）。加氏乳酸桿菌可以顯著（p＜0.05）降低Ⅱ型糖尿病小鼠的空腹血糖和餐后血糖水平[7]，這與本文研究結(jié)果一致。

圖2 實(shí)驗(yàn)期間小鼠血糖水平變化Fig.2 Chang in blood glucose levels ofmice during the test

2.3 鼠李糖乳酸桿菌對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠的OGTT及AUC的影響

第4周時(shí)，在灌胃葡萄糖后，各組小鼠的血糖均呈急劇上升，到15m in達(dá)到頂峰，之后逐漸下降（圖3A）。比較不同組小鼠血糖的下降趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，NG變化非常平緩，在2h后恢復(fù)正常。MG在2h后依然保持在較高水平（14.2mmol/L），說(shuō)明葡萄糖耐受能力顯著降低（p＜0.05），符合Ⅱ型糖尿病糖耐量降低的特征。LG小鼠2h后血糖水平下降到11.3mmol/L，略高于正常值。

圖3 鼠李糖乳酸桿菌對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠的OGTT及AUC的影響Fig.3 Effectof Lactobacillus rhamnosus in type 2 diabeticmice as revealed by oral glucose tolerance tests and AUC

由圖3B中可看出，MG與PG的AUC面積顯著高于NG（p＜0.05），而LG的AUC面積顯著低于MG（p＜0.05）。說(shuō)明鼠李糖乳酸桿菌對(duì)小鼠的糖耐量具有顯著改善作用。喂食鼠李糖乳酸桿菌12周后，與MG相比，其AUC面積顯著低于MG（p＜0.05），并與NG和PG無(wú)顯著性差異（圖3C和圖3D）。此與Yadav等[8]研究表明的嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌可以改善高糖引起的糖尿病小鼠葡萄糖不耐受結(jié)果一致。

2.4 鼠李糖乳酸桿菌對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠血清中糖基化血紅蛋白、胰島素及內(nèi)毒素的影響

糖基化血紅蛋白反映葡萄糖分子連接到紅血細(xì)胞中的血紅蛋白的數(shù)量，所以它是用于監(jiān)視長(zhǎng)期的血糖平衡的一個(gè)重要因素[11]。內(nèi)毒素已被證明是高脂飲食引發(fā)Ⅱ型糖尿病的一個(gè)主要原因[12]。從表1可看出，喂食鼠李糖乳酸桿菌12周后，小鼠血清中糖基化血紅蛋白和內(nèi)毒素的水平較MG分別顯著降低了18%和21%。Cani等[13]研究表明雙歧桿菌的增加可有效降低糖尿病小鼠體能內(nèi)毒素水平，因此減輕糖尿病癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，糖尿病小鼠血清中胰島素的水平恢復(fù)正常。

2.5 鼠李糖乳酸桿菌對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠血清中炎癥因子的影響

高脂飲食可導(dǎo)致促炎因子如腫瘤壞死因子-α和白介素-6等的升高[13]，促炎因子被證實(shí)可引起胰島素抵抗[14]。白介素-10是一種抗炎細(xì)胞因子，抑制抗原呈遞和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[15]。見(jiàn)表2，與MG相比，喂食鼠李糖乳酸桿菌12周后可顯著降低小鼠血清中腫瘤壞死因子-α和白介素-6的水平（32%和30%，p＜0.05），并增加白介素-10的含量（17%，（p＜0.05））。Calcinaro等[16]研究表明喂食VSL#3可提高糖尿病小鼠的白介素-10水平從而預(yù)防糖尿病的發(fā)生，其結(jié)果與本研究一致。

2.6 鼠李糖乳酸桿菌對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟中抗氧化指標(biāo)的影響

MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映出肝細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。GSH是存在于肝臟中主要的水溶性抗脂質(zhì)過(guò)氧化的物質(zhì)，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，因而GSH含量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素[17]。而GSH-Px以GSH為底物和SOD共同清除機(jī)體ROS，減輕和阻止ROS的過(guò)氧化作用。表3表明，LG的GSH-Px和GSH的水平與MG相比分別升高了34%和15%，但是ROS的水平無(wú)顯著變化。與MG相比，LG和PG的SOD水平分別顯著提高了49%和25%，MDA的含量則分別顯著下降了27%和18%。Yadav等[8]研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌可提高糖尿病大鼠的抗氧化能力，并增加肝臟和胰腺的GSH的含量，從而延緩糖尿病的進(jìn)程。

2.7 小鼠胰腺HE染色

表1 鼠李糖乳酸桿菌對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠血清中糖基化血紅蛋白、內(nèi)毒素及胰島素的影響Table1 Effect of Lactobacillus rhamnosus on HbA1c，insulin and endotoxin in type 2 dibeticmice

表2 鼠李糖乳酸桿菌對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠血清中炎癥因子的影響Table2 Effectof Lactobacillus rhamnosus on serum inflammatory factors in type 2 dibeticmice

表3 鼠李糖乳酸桿菌對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟中抗氧化指標(biāo)的影響Table3 Effectof Lactobacillus rhamnosus on antioxidant indices in type 2 dibeticmice

光鏡下觀察，NG小鼠胰島與外分泌腺之間邊界清楚，胰島多為圓形或橢圓形的細(xì)胞團(tuán)，胰島內(nèi)細(xì)胞排列整齊，大小一致分散于胰腺腺泡之間，胞漿呈淺紅色著染，細(xì)胞核呈藍(lán)色著染（圖4a）。MG小鼠胰島萎縮，形態(tài)極不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量減少，大小不一，部分細(xì)胞核缺失，只留伊紅淺染的細(xì)胞質(zhì)（圖4b）。PG和LG小鼠胰島數(shù)及島內(nèi)細(xì)胞數(shù)較MG小鼠多，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞分布均勻，只有少部分的細(xì)胞核固縮（圖4c～d）。已有研究報(bào)道嗜酸乳桿菌對(duì)STZ所致的Ⅱ型糖尿病小鼠的胰島結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用[18]，這與本文的研究結(jié)果一致。

圖4 小鼠胰腺切片HE染色結(jié)果（200×）Fig.4 HE staining of pancreatic tissue ofmice（200×）

3 結(jié)論

本研究表明，鼠李糖乳酸桿菌可有效預(yù)防高脂與STZ誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，從而降低血糖水平和改善糖尿病相關(guān)癥狀。推測(cè)這可能是由于鼠李糖乳酸桿菌保護(hù)胰島細(xì)胞免受損傷，并增強(qiáng)了機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)性和抗氧化能力，未來(lái)可進(jìn)一步研究其是否對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達(dá)量和腸道菌群構(gòu)成有影響。

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